用于体外扩增和活化自然杀伤细胞的细胞培养基制造技术

本发明专利技术涉及一种用于体外扩增和活化自然杀伤细胞的培养基，该培养基包含纳豆激酶，专属针对自然杀伤细胞提供优化的培养环境，且在不使用癌饲养细胞共同培养的条件下，使用该培养基可有效提升细胞扩增倍数，并产生高纯度及对癌细胞具有高度毒杀活性的自然杀伤细胞。

【技术实现步骤摘要】
用于体外扩增和活化自然杀伤细胞的细胞培养基
本专利技术涉及一种用于体外扩增和活化自然杀伤细胞的细胞培养基。
技术介绍
自然杀伤细胞(NaturalKillerCells；NK细胞)是一群具备CD3-CD56+表达型的细胞，通常存在于淋巴结、各器官及外周血液中。NK细胞在人体外周血液淋巴细胞中约占5～20％，因此外周血液是NK细胞方便的来源之一。NK细胞在1970年代被发现具有毒杀癌细胞的特性，且事先不需要经过教育或致敏(Priming)的过程。之后研究发现，NK细胞除了可以毒杀癌细胞之外，还可以杀死病毒感染的细胞、癌化的细胞及老化应激细胞(StressedCells)。过去的研究已显示NK细胞具有治疗肿瘤的潜力。自体NK细胞治疗癌症的做法，是将病人外周血液的NK细胞分离后，以体外细胞扩增和活化技术培养约14天，再输注入该病人体内以达到治疗癌症的效果。过去实施体外细胞扩增和活化方法时，多数将NK细胞与癌饲养细胞(Cancerfeedercell)共同培养，以达到大幅提高NK细胞数量的目的。但使用癌饲养细胞的扩增方法仍无法解决安全性的问题。在将扩增后自然杀伤细胞输注病人体内前，难以确定癌饲养细胞是否已完全去除，因此产生安全性的疑虑。再者，即使体外培养后NK细胞数量有大幅提升，若该NK细胞毒杀癌细胞的活性不佳，后续应用于自体细胞疗法的效果仍非常有限。据此，有必要开发一种培养基，在不使用癌饲养细胞共同培养的条件下，使用该培养基能有效率地提升NK细胞扩增倍数，并产生高纯度及高癌细胞毒杀活性的NK细胞。纳豆激酶(nattokinase)是纳豆枯草杆菌(Bacillussubtilisnatto)所分泌的胞外酶，已知具有溶解血栓的活性及分解纤维蛋白的功能，可应用于心血管疾病的预防及治疗。纳豆激酶目前系以口服给予，以营养补充品的形式使用。尽管已有研究探讨对象食用纳豆或纳豆萃取物，有助于调节对象的免疫力(Takedaetal.,Traditional&KampoMedicine,Vol.3Iss.2100-106,2016)，但其作用的有效成分及相关机制目前仍不清楚。此外，纳豆激酶应用于体外免疫细胞培养方法与效用，目前未有相关研究。
技术实现思路
本专利技术于一方面，提供一种用于体外扩增和活化自然杀伤细胞的培养基，该培养基包含浓度范围为5FU/ml至20FU/ml的纳豆激酶。本专利技术于另一方面，提供一种用于体外扩增和活化自然杀伤细胞的培养基，该培养基更包含辅酶Q10。于本专利技术的一些具体实施方面，该培养基包含浓度为100nM至1000nM的辅酶Q10。本专利技术于另一方面，提供一种用于体外扩增和活化自然杀伤细胞的培养基，该培养基还包含白介素-2(IL-2)、白介素-12(IL-12)以及白介素-18(IL-18)；其中该白介素-2(IL-2)于该培养基中的浓度为200～1000IU/ml；其中该白介素-12(IL-12)于该培养基中的浓度为10～50ng/ml；其中该白介素-18(IL-18)于该培养基中的浓度为100～200ng/ml。本专利技术于另一方面，提供一种用于体外扩增和活化自然杀伤细胞的培养基，该培养基更包含基础培养基；其中该基础培养基为AIMV、X-VIV015、CellGroSCGM、KBM501、DMEM或RPM1-1640培养基。在本专利技术一些具体实施方面，以前述培养基培养后的细胞中，21％至41％是NKG2A+CD3-CD56+细胞。在本专利技术一些具体实施方面，以前述培养基培养后的细胞中，41％至71％是TRAIL+CD3-CD56+细胞。在本专利技术一些具体实施方面，以前述培养基培养后的细胞中，92％至97％是自然杀伤细胞。在本专利技术一些具体实施方面，以前述培养基培养后的细胞，当该细胞与K562细胞在体外以5:1的比率共同培养时，所述细胞具有63％至81％的癌细胞毒杀活性。附图说明图1是本专利技术实施例1的NK细胞体外扩增和活化方法流程图；图2是本专利技术所产生的细胞扩增倍数分析；图3是本专利技术所产生之NK细胞毒杀癌细胞的能力测试结果，其中图3A是以K562作为被NK细胞毒杀的癌细胞株，其中图3B是以HepG2、HT-29以及A549作为被NK细胞毒杀的癌细胞株；图4是本专利技术所产生的NK细胞抑制癌细胞生长的小鼠实验结果。具体实施方式有鉴于上述待解决的问题，本专利技术提出一种用于体外扩增和活化NK细胞的培养基，在不使用癌饲养细胞共同培养的条件下，所述培养基含有纳豆激酶，可提供NK细胞良好的培养环境，有效率地提升NK细胞扩增倍数，并产生高纯度及高癌细胞毒杀活性的NK细胞。定义用于本说明书，“自然杀伤细胞”(Naturalkillercell，简称NK细胞)指细胞表面抗原呈现CD3-CD56+的细胞。用于本说明书，“癌饲养细胞”(cancerfeedercell)指体外免疫细胞培养中，加入活的癌细胞共同培养以达到提升免疫细胞扩增的效果，加入的其他活的癌细胞称之为癌饲养细胞。用于本说明书，“细胞扩增倍数”以下列方式判断：“经体外培养14天后的细胞数量”除以“自外周血单核细胞分离出的起始NK细胞数量”。用于本说明书，“毒杀癌细胞的活性”以K562细胞株或其他癌细胞株为靶标细胞(targetcell)，并以NK细胞为效应细胞(effectorcell)，在效应细胞与靶标细胞之比例(E:Tratio)为5:1的情况下，将靶标细胞死亡的比例做为毒杀效率。材料与方法本专利技术所述外周血样品，是依据伦理委员会通过之计划，自受试者手臂采集全血，置于无菌采血管，于室温存放待后续处理。本专利技术所使用的基础培养基可选用自：CellGroSCGM(CellGenix公司)、KBM501(KohjinBio公司)、AIM-V(ThermoFisher公司)、X-VIV015(Lonza公司)、DMEM及RPM1-1640等市售培养基。本专利技术所述培养基中，有时含有适当的蛋白质、细胞激素、抗体、血清、化合物等成分。所述细胞激素有时为白介素-2(IL-2)、白介素-3(IL-3)、白介素-7(IL-7)、白介素-12(IL-12)、白介素-15(IL-15)、白介素-18(IL-18)或白介素-21(IL-21)。自PBMC分离NK细胞的方法包括但不限于使用Dynabeads(Invitrogen公司)、CliniMACS磁珠(MiltenyiBiotec公司)或其他市售的免疫磁珠，将表达细胞表面抗原CD3和/或CD34的细胞分离除去，达到纯化NK细胞的效果。以流式细胞仪方式分析细胞表面抗原以2x105细胞/50μl将扩增和活化后的细胞置于96孔盘，并加入3μl荧光标记之抗体于4℃反应15分钟，接着以磷酸盐缓冲生理食盐水(Phosphatebuffersaline；简称PBS)清洗3次后，加入400μlPBS悬浮细胞，再以流式细胞仪(Beckman公本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于体外扩增和活化自然杀伤细胞的培养基，其包含浓度范围为5FU/ml至20FU/ml的纳豆激酶。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于体外扩增和活化自然杀伤细胞的培养基，其包含浓度范围为5FU/ml至20FU/ml的纳豆激酶。


2.如权利要求1所述的培养基，其另包含辅酶Q10。


3.如权利要求2所述的培养基，其中所述辅酶Q10的浓度为100nM至1000nM。


4.如权利要求3所述的培养基，其另包含白介素-2(IL-2)、白介素-12(IL-12)以及白介素-18(IL-18)；其中所述白介素-2(IL-2)在所述培养基中的浓度为200～1000IU/ml；其中所述白介素-12(IL-12)在所述培养基中的浓度为10～50ng/ml；其中所述白介素-18(IL-18)在所述培养基中的浓度为100～200ng/ml。


5.如权利要求4所述的培养基，其另包含基础培养基；其中所述基础培养基为AIMV、X-VIV015、Cell...

【专利技术属性】
技术研发人员：张顺浪，林杰良，杨智雅，
申请(专利权)人：基亚生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：中国台湾;71