一种增强NK细胞毒作用的培养液及其制备方法技术

本发明专利技术涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种增强NK细胞毒作用的培养液及其制备方法。一种增强NK细胞毒作用的培养液，所述无血培养液包括IL‑18、IL‑13、IL‑19、IL‑27、IL‑23、PRDX1、DEF1和1640基础培养基，IL‑18在培养液中的终浓度为5000‑8000IU/Ml，IL‑13在培养液中的终浓度为3000‑5000UI/ML，IL‑19在培养液中的终浓度为5000‑6000UI/ML，IL‑27在培养液中的终浓度为5000‑6000UI/ML，IL‑23在培养液中的终浓度为5000‑6000UI/ML，PRDX1的浓度为50μg/L、DEF1的浓度为60μg/L。本发明专利技术提供增强NK细胞毒作用的培养液与普通NK细胞培养液相比可明显增强NK细胞毒性及活性，为NK细胞在免疫细胞治疗中提供了广泛的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种增强NK细胞毒作用的培养液及其制备方法
本专利技术涉及细胞生物学
，具体涉及一种增强NK细胞毒作用的培养液及其制备方法。
技术介绍
NK细胞又称自然杀伤细胞(naturalkillercell，NK细胞)，是机体内重要的免疫细胞，作为与T细胞、B细胞并列的一大类淋巴细胞群体，是天然免疫系统的重要成员，负责杀伤老化、受病毒感染、肿瘤等异常细胞。肿瘤是困扰人类健康的重大疾病，但由于其高度的复杂性、多样性、可变性和异质性，一直找不到一种更加深入治疗方法，随着医学的进步，癌症的治愈率、生存率都有显著的改善，但现在仍然是难治性的疾病。NK细胞的靶细胞主要是肿瘤细胞、病毒感染细胞、某些自身组织细胞(如血细胞)及寄生虫等，因此NK细胞是机体抗肿瘤、抗感染免疫的重要组成部分。由于这些特点，NK细胞在细胞免疫治疗上有着广泛的应用前景。在体外被活化的NK细胞毒性较高，可用作免疫细胞的治疗制剂。人体体外及动物试验证实了其对各种癌症治疗的可能性：利用肿瘤细胞系的方法，确认其对血液系统肿瘤(白血病和淋巴瘤等)、肝癌、肺癌、肾癌、神经系统肿瘤和皮肤癌等均具有体外细胞毒性，特别是对白血病和神经源性肿瘤已明确了其临床及非临床的治疗效果。2009年NK细胞治疗技术就已列入国家三类医疗技术目录。充足的细胞数量和强烈的细胞毒性是细胞治疗疗效提升的关键因素。现有的细胞免疫治疗中的NK细胞主要是通过分离血液中的淋巴细胞，经体外培养、各种细胞因子刺激诱导扩增培养，得到一定量的细胞后回输人体，进行肿瘤治疗。现有NK细胞的培养基主要是由基础培养基、动物血清和各种因子培养组成，培养得到的NK细胞增殖倍数有限、数量不多，不能广泛的用于治疗，限制了NK细胞在免疫细胞治疗中的应用。目前急需一种细胞纯度高、扩增倍数大的NK细胞的的培养液及其培养方法。
技术实现思路
鉴于现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种增强NK细胞毒作用的培养液及其制备方法。本专利技术提供的培养液与普通NK细胞培养液相比可明显增强NK细胞毒性及活性。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案。一种增强NK细胞毒作用的培养液，所述无血培养液包括IL-18、IL-13、IL-19、IL-27、IL-23、PRDX1、DEF1和1640基础培养基，IL-18在培养液中的终浓度为5000-8000IU/Ml，IL-13在培养液中的终浓度为3000-5000UI/ML，IL-19在培养液中的终浓度为5000-6000UI/ML，IL-27在培养液中的终浓度为5000-6000UI/ML，IL-23在培养液中的终浓度为5000-6000UI/ML，PRDX1的浓度为50μg/L、DEF1的浓度为60μg/L。所述的增强NK细胞毒作用的培养液的制备方法具体包括以下制备方法。步骤1、基础培养基的制备。1)溶解培养基：将干粉培养基10.4g溶于总量1/3的水中，再用水洗包装袋内面两次，倒入培养液中，振荡或超声助溶，一般不要加热助溶。2)补加试剂：根据基础培养基说明和试验需要加入NaHCO3、谷氨酰胺。3)加抗生素：一般抗生素终浓度为：青霉素100U/ml，链霉素100U/ml。市售青霉素为80万U/瓶，可溶于4ml体积，每一升培养液中加0.5ml即可。市售链霉素为100万U/瓶，可溶于5ml体积，每一升培养液中也加0.5ml即可。无链霉素的情况下，用庆大霉素代替，终浓度调为50～200U/ml。4)调pH值：加水到800-1000ml，然后用5％NaHCO3调节pH到7.2。5)过滤除菌：宜采用0.45um和0.22um滤膜各一张，上层为0.45um，下层为0.22um，以保证过滤效果。注意滤膜正面(光面)朝上。过滤后分装于小瓶中(100或200ml)。所得溶液为基础培养基。步骤2、加小牛血清：根据培养基配制的量将小牛血清分装，-20℃冷冻保存。临用前将加入小牛血清(10％～20％体积分数)。步骤3、在配制好的基础培养基中加入IL-18终浓度为7000IU/Ml、IL-13终浓度为4000UI/ML、IL-19终浓度为5500UI/ML、IL-27终浓度为5500UI/ML、IL-23终浓度为5500UI/ML、PRDX1(50μg/L)、DEF1(60μg/L)混匀后即可备用。进一步地，所述的水为新制备的三蒸水，一般在试验前当天或前一天制备为好。本专利技术提供的增强NK细胞毒作用的培养液中组成成分及其药理作用如下。IL-18属于IL-1配体家族，结构与IL-1蛋白家族相似。人IL-18cDNA编码193个氨基酸，半胱氨酸天冬酶在N端将其水解为成熟的IL-18，发挥其生物学活性。其位于染色体11q22.2-22.3，由6个外显子和5个内含子组成，cDNA全长约1.1kb。IL-18是一种作用强大的前炎症细胞因子，最具特征的功能是调节细胞增生，分化及细胞外基质生成，故IL-18在糖尿病肾病(DN)的发生、发展中起重要作用。它是一个前炎症因子，可调节多种细胞发育及细胞因子分泌。研究表明，它是独特的依赖细胞因子周围环境而刺激Thl和Th2细胞反应的细胞因子。能促进外周单个核细胞产生IFN-γ、IL-2和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子等细胞因子，增强NK细胞和Thl细胞的细胞毒作用，促进T细胞的增殖，并在Thl细胞分化和免疫反应中有促进和调节作用。在免疫调节、抗感染、抗肿瘤及慢性炎症性疾病发病过程中起着重要作用。IL-13由TH2细胞产生，分子量约10KD。IL-13可诱导单核细胞分化，增强其MHCⅡ类分子的表达；抑制lps诱导的单核因子分泌，控制炎症反应；诱导B细胞增殖及合成IgE类抗体，增强B细胞表面MHCⅡ类分子、CD23及CD72的表达；协同IL-2刺激NK细胞产生IFN，从而促进单核-巨噬细胞活化和TH1型细胞免疫反应。IL-13还具有抑制HIV-1在巨噬细胞内复制，诱导中性粒细胞中IL-1RA基因表达和蛋白质合成等多种功能。IL-19：成熟区153个氨基酸，与IL-10有同源性；染色体1q32。对抗原呈递细胞具有调节和促增殖效应。活化Stat3，受体为IL20R1/IL20R2。IL-27属于IL-12/IL-6家族成员。主要由抗原呈递细胞产生，能促进T细胞增殖并向T辅助淋巴细胞(Thl)细胞方向分化，分泌γ干扰素IFN，在抗感染免疫及抗肿瘤免疫等方面发挥作用，参与机体多种疾病的演变过程。与IL-12有同源性，异源双聚体，α链为p28，与IL-12p35同源，其β链为EBI3。来源：IL-27由p28(IL-12的p35相关多肽)和EBI3(EB病毒诱导的基因3)组成异二聚体。其中p28与IL-12的p35亚基同源，EBI3与IL-12的p40亚基同源。人p28和EBI3基因分别定位于16p11和16p13.3。p28必须与EBI3结合，才具有IL-27生物学活性。由抗原呈递细胞活化早期阶段产生，促进naiveT细胞增殖，与IL-12协同刺激T细胞的γ干扰素产生，促进早期Th1细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种增强NK细胞毒作用的培养液，其特征在于，所述无血培养液包括IL-18、IL-13、IL-19、IL-27、IL-23、PRDX1、DEF1和1640基础培养基，IL-18的浓度为5000-8000IU/Ml，IL-13的浓度为3000-5000UI/ML，IL-19在培养液中的浓度为5000-6000UI/ML，IL-27的浓度为5000-6000UI/ML，IL-23的浓度为5000-6000UI/ML，PRDX1的浓度为50μg/L、DEF1的浓度为60μg/L。/n

【技术特征摘要】
1.一种增强NK细胞毒作用的培养液，其特征在于，所述无血培养液包括IL-18、IL-13、IL-19、IL-27、IL-23、PRDX1、DEF1和1640基础培养基，IL-18的浓度为5000-8000IU/Ml，IL-13的浓度为3000-5000UI/ML，IL-19在培养液中的浓度为5000-6000UI/ML，IL-27的浓度为5000-6000UI/ML，IL-23的浓度为5000-6000UI/ML，PRDX1的浓度为50μg/L、DEF1的浓度为60μg/L。


2.如权利要求1所述的增强NK细胞毒作用的培养液的制备方法，其特征在于，包括以下制备方法：
步骤1、基础培养基的制备：
1)溶解培养基：将干粉培养基10.4g溶于总量1/3的水中，再用水洗包装袋内面两次，倒入培养液中，振荡或超声助溶；
2）补加试剂：加入NaHCO3、谷氨酰胺；
3)加抗生素：一般抗生素终浓度为：青霉素100U/ml，链霉素100U/ml；青霉素为80万U/瓶，溶于4ml体积，每一升培养液中加0....

【专利技术属性】
技术研发人员：邱宇，高健，崔新宇，高佳美，董洪选，
申请(专利权)人：辽宁盛京干细胞科技有限公司，辽宁启福干细胞生物科技有限责任公司，北京启福生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁;21