一种人多能干细胞分化的自然杀伤细胞及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及干细胞生物学领域，公开了一种人多能干细胞分化的自然杀伤细胞的制备方法，包括以下步骤：S1、形成拟胚体；S2、拟胚体定向永久造血分化获得造血前体细胞；S3、造血前体细胞分化获得自然杀伤细胞。本发明专利技术还公开了由前述方法制得的自然杀伤作为细胞预防和/或治疗肿瘤的药物组合物的应用。本发明专利技术实现了高效稳定的NK细胞的分化，在诱导分化期间使EB贴壁分化以及延长TGFB抑制剂处理，可快递诱导获得10％以上的CD34+CD45+永久造血HPCs，具备高效稳定、成本低、适于规模化细胞制剂生产的优势；本发明专利技术的方法操作简便，分化获得的NK细胞具有典型的NK细胞表面标记分子，其抗肿瘤功能要优于脐带血来源的NK细胞，具有极大的科研及临床应用潜能。

【技术实现步骤摘要】
一种人多能干细胞分化的自然杀伤细胞及其制备方法与应用
本专利技术涉及干细胞生物学领域，具体涉及一种人多能干细胞分化的自然杀伤细胞及其制备方法与应用。
技术介绍
自然杀伤(NatureKiller，NK)细胞对肿瘤细胞具有杀伤作用，特别是嵌合抗原受体NK(CAR-NK)细胞，已经在临床上被报道具有良好的癌细胞清除作用。然而，直接从脐带血或者外周血分离扩增NK细胞具有一定的难度，并且需要对T细胞进行清除，否则会发生严重的移植物抗宿主病(GVHD)。特别地，很多患者体内的NK细胞偏少，可能会导致NK细胞分离扩增失败。同时，不同供体NK细胞质量差异大，致使难以形成标准化产品。从人的多潜能干细胞(humanpluripotentstemcells；hPSCs)，包括胚胎干细胞(humanembryonicstemcells；hESCs)以及诱导多能干细胞(humaninducedpluripotentstemcell；hiPSCs)，分化获得自然杀伤细胞(naturekillercells，NK)，具有十分重要的应用前景。由于hPSCs具有无限增值的能力，为NK细胞的获得提供稳定的细胞来源。因此，在体外从hPSCs大规模标准化地制备NK细胞，是NK细胞产品成药的有效的解决途径。在造血分化过程中，hPSCs首先分化为造血前体细胞，然后再进一步分化为自然杀伤细胞。值得注意的是，在造血分化过程中存在着原始造血(primitivehematopoiesis)和永久造血(definitivehematopoiesis)两个阶段，而原始造血分化获得的造血前体细胞(hematopoieticprogenitorcells，HPCs)不具备有效分化为淋巴细胞(包括T、B和NK细胞)的能力，而只有永久造血分化获得的HPCs具备有效分化为淋巴细胞，如NK细胞的能力。已有报道表明，在早期造血分化过程中，通过短暂地添加TGFB抑制剂，可以抑制原始造血；并且通过上述方法，可以特异地富集永久造血分化得到HPCs，具备高效分化为NK细胞的能力；但是，现有的永久造血分化体系，分化获得HPCs的效率较低，从而限制了从人多能干细胞高效诱导获得NK细胞。现有技术中，专利CN102388130A公开了一种多能细胞的分化，其至少存在以下问题：造血分化未绕过原始造血阶段，且未进行NK细胞分化。专利CN107429230A公开了一种用于诱导造血细胞分化的方法和组合物，其至少存在以下问题：(1)EB3D培养效率低；(2)使用成分不确定的商业培养基以及血清等异源物质，不利于临床级别的细胞产品制备；(3)需要富集CD34+CD45+细胞进行NK细胞诱导，过程繁琐。专利CN102822332A公开了一种从源于hESC的成血管细胞产生自然杀伤细胞和树突细胞的方法，其至少存在以下问题：(1)使用了成分不明确的昂贵的商业培养基以及含血清培养基；(2)没有绕过原始造血阶段；(3)分化过程中涉及将EB消化为单细胞并接种到Methylcellulose培养体系中以进行下一步分化，过程繁琐，不利于临床级细胞的规模化生产。专利CN111235105A公开了一种从人多能干细胞分化为自然杀伤细胞的方法及应用，其至少存在以下问题：(1)永久造血得到的CD34+CD45+HPCs比例低，不利于后续大规模地分化获得NK；(2)专利中提到的分化得到的造血干细胞或者造血祖细胞，大部分为CD34+CD45-的内皮细胞或者间充质细胞，因而，其通过各种优化所得的诱导分化条件，并不确定是否可以直接有助于HPCs的生成。综上所述，NK细胞具有重要的肿瘤免疫治疗前景，而人多能干细胞可以为NK细胞的制备提供稳定可靠的细胞来源。鉴于已有NK细胞分化体系效率较低、操作复杂，因此急需开发一种高效、稳定、简便的人多能干细胞向NK细胞制备体系，为NK细胞的规模化制备和临床应用奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对已有人多能干细胞分化获得NK细胞体系的低效、操作复杂等一系列问题，提供一种快速高效、简便的人多能干细胞诱导分化为自然杀伤细胞的方法。本专利技术的另一目的是提供由上述方法分化而得的自然杀伤细胞。本专利技术的另一目的是提供上述自然杀伤细胞作为药物组合物的应用。为达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，一种从人多能干细胞诱导分化获得的自然杀伤细胞，其表达表面标记分子CD56、NKp46、CD94和CD16。第二方面，一种从人多能干细胞定向诱导分化为自然杀伤细胞的方法，包括以下步骤：S1、形成拟胚体；S2、拟胚体定向永久造血分化获得造血前体细胞；S3、造血前体细胞分化获得自然杀伤细胞。进一步地，所述步骤S1包括：将人多能干细胞制备成单细胞悬液，然后接种到培养容器中，在添加有抗凋亡抑制剂的情况下，静置以形成拟胚体。进一步地，所述步骤S2包括：S21、将拟胚体静置，使之自然沉降，然后去除原有培养基，并加入第一分化培养基重悬拟胚体，再转移到包被有基质蛋白的培养器皿中，使拟胚体贴壁分化培养；所述第一分化培养基是在基础培养基中，添加BMP信号通路激活剂和细胞因子；S22、去除第一分化培养基，加入第二分化培养基进行诱导分化，直至高效获得永久造血的HPCs；所述第二分化培养基是在第一分化培养基的基础上加上TGFB抑制剂。进一步地，所述基质蛋白为纤维粘连蛋白(Fibronectin)、层粘连蛋白(Laminin)、玻璃粘连蛋白(Vitronectin)、胶原蛋白(Collagen)、粘接细胞黏附分子-1(MAdCAM-1)、血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)、细胞间黏附分子(ICAM)及其变体中的至少一种。进一步地，所述BMP信号通路激活剂选自BMP2、BMP4、SB4、SJ000291942、SJ000063181、SJ000370178、异甘草素、香叶木素、芹菜素、鹰嘴豆芽素中的至少一种。进一步地，所述细胞因子选自EGF、VEGF、bFGF、SCF、FLT3L、IL3、IL6、IGF-1、TPO、PGF、PDGF中的至少一种。进一步地，所述TGFB抑制剂选自Lefty-A、Lefty-B、Lefty-1、Lefty-2、SB431542、SB202190、SB505124、NPC30345、SD093、SD908、SD208、LY2109761、LY364947、LT580276、A83-01及其衍生物中的至少一种。第二分化培养基中TGFB抑制剂累计的处理时间为1～2周。进一步地，所述步骤S3包括：去除第二分化培养基，然后加入第三分化培养基，造血前体细胞诱导分化为自然杀伤细胞；所述第三分化培养基是在基础培养基中添加集落刺激因子、白细胞介素。进一步地，所述集落刺激因子选自G-CSF、M-CSF、GM-CSF、IL-3、EPO、TPO、SCF、FLT3-L中的至少一种。进一步地，第三分化培养基所述白细胞介素选自IL-1、IL-2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从人多能干细胞诱导分化获得的自然杀伤细胞，其表达表面标记分子CD56、NKp46、CD94和CD16。/n

【技术特征摘要】
1.一种从人多能干细胞诱导分化获得的自然杀伤细胞，其表达表面标记分子CD56、NKp46、CD94和CD16。


2.一种从人多能干细胞定向诱导分化为自然杀伤细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、形成拟胚体；
S2、拟胚体定向永久造血分化获得造血前体细胞；
S3、造血前体细胞分化获得自然杀伤细胞。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤S1包括：将人多能干细胞制备成单细胞悬液，然后接种到培养容器中，在添加有抗凋亡抑制剂的情况下，静置以形成拟胚体。


4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤S2包括：
S21、将拟胚体静置，使之自然沉降，然后去除原有培养基，并加入第一分化培养基重悬拟胚体，再转移到包被有基质蛋白的培养器皿中，使拟胚体贴壁分化培养；
所述第一分化培养基是在基础培养基中，添加BMP信号通路激活剂和细胞因子；
S22、去除第一分化培养基，加入第二分化培养基进行诱导分化；
所述第二分化培养基是在第一分化培养基的基础上加上TGFB抑制剂。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述基质蛋白为纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、玻璃粘连蛋白、胶原蛋白、粘接细胞黏附分子-1、血管细胞粘附分子-1、细胞间黏附分子及其变体中的至少一种；所述BMP信号通路激活剂选自BMP2、BMP4、SB4、SJ000291942、SJ000063181、SJ000370178、异甘草素、香叶木素、芹菜素、鹰嘴豆芽素中的至少一种；所述细胞因子选自EGF、VEGF、bFGF、SCF、FLT3L、IL3、IL6、IGF-1、TPO、PGF、PDGF中的至少一种；所述TGFB...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：深圳市安棣生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：广东;44