一种高效敲除NK细胞中CD96基因的方法技术

本发明专利技术公开了一种高效敲除NK细胞中CD96基因的方法，所述方法是利用CRISPR/Cas9基因编辑系统，以电穿孔转染方式将sgRNA与Cas9蛋白的复合物导入经扩增的NK细胞中，其中：sgRNA的序列选自SEQ ID NO.1～10所示序列中的任意一种。采用本发明专利技术所述方法可实现对NK细胞中CD96基因的敲除，不仅敲除效率较高，而且所获得的不表达CD96的NK细胞可解除CD155+肿瘤细胞对NK细胞的免疫抑制作用，相对于野生型NK细胞，在体内、体外实验中均展现出更强的抗肿瘤活性，明显提高了NK细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤活性，可望开发成安全有效的抗肿瘤生物制剂。

【技术实现步骤摘要】
一种高效敲除NK细胞中CD96基因的方法
本专利技术涉及一种高效敲除NK细胞中CD96基因的方法，属于基因编辑

技术介绍
自然杀伤细胞(naturalkillercell，NK细胞)是机体重要的免疫细胞，来源于骨髓淋巴样干细胞，其分化、发育依赖于骨髓及胸腺微环境，主要分布于骨髓、外周血、肝、脾、肺和淋巴结。NK细胞不同于T、B细胞，是一类无需预先致敏就能非特异性杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的淋巴细胞，它不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生，能够识别靶细胞、杀伤介质。研究表明：虽然NK细胞具有强大的天然抗肿瘤功能，且无需肿瘤细胞抗原(靶点)预先致敏即可识别并攻击肿瘤细胞，但瘤体组织内活化NK细胞数量少、活性低是针对实体肿瘤的NK细胞免疫治疗疗效的主要障碍，尽管采用体外扩增方法可获得高数量、高纯度NK细胞，但过继输注的NK细胞只有很少部分透过毛细血管进入实体肿瘤微环境，接触并杀伤肿瘤细胞，并不能解决瘤体组织内活化NK细胞数量少这个问题；另外，研究者陆续发现TIGIT(TcellimmunoglobulinandITIMdomain)是新的免疫检查点之一，它与配体PVR/CD155(脊髓灰质炎病毒受体)结合可显著抑制T细胞或NK细胞的免疫应答；而CD96和TIGIT共同拥有一个受体，即PVR/CD155(脊髓灰质炎病毒受体)，在小鼠模型中敲除CD96基因可增强NK细胞的抗肿瘤活性。尽管抗CD96抗体在动物水平的研究中展现出了理想的疗效，但目前还没有靶向CD96的药物被批准上市。另外，基因编辑技术是研究功能基因组的重要技术手段，目前已经发展了四代基因编辑技术：大范围核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶、CRISPR等，其中，CRISPR系统因其高效、廉价而被广泛应用。CRISPR/Cas9是一种来源于原核生物的新型核酸酶系统，它由导向序列sgRNA和核酸酶Cas9两种元件组成，目前采用CRISPR/Cas9系统已经成功的在人、鼠、斑马鱼、拟南芥、水稻、果蝇、家蚕等物种中实现了基因敲除，但至今未见对NK细胞中CD96基因进行敲除的相关报道。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术的目的是提供一种高效敲除NK细胞中CD96基因的方法，从而获得不表达CD96的NK细胞，以提高NK细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤活性，使其能开发成安全有效的抗肿瘤生物制剂，为过继免疫治疗肿瘤及病毒感染性疾病(例如HIV/AIDS、新型冠状病毒肺炎/COVID-19)提供新的生物制剂。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用如下技术方案：一种高效敲除NK细胞中CD96基因的方法，所述方法是利用CRISPR/Cas9基因编辑系统，以电穿孔转染方式将sgRNA与Cas9蛋白的复合物导入经扩增的NK细胞中，其中：sgRNA的序列选自SEQIDNO.1～10所示序列中的任意一种。一种优选方案，sgRNA的序列选自SEQIDNO.5或9或10所示序列。一种优选方案，所述复合物中，sgRNA与Cas9蛋白的质量比为1:(3～5)。进一步优选方案，所述复合物中，sgRNA与Cas9蛋白的质量比为1:4。一种优选方案，所述sgRNA经过磷酸化修饰。进一步优选方案，进行磷酸化修饰的位点为：3'端和5'端各3个硫代基和甲氧基。一种优选方案，所述Cas9蛋白先经过大肠杆菌密码子优化，然后构建到Pet28a表达质粒骨架中。进一步优选方案，所述Cas9蛋白具有SEQIDNO.11所示序列。一种实施方案，所述sgRNA的制备包括如下步骤：a)退火，向每条sgRNA添加TAGG内切酶粘性末端上游序列及AAAC内切酶粘性末端的下游序列后一起进行退火处理；b)线性化，将pUC57-sgRNA表达载体经过BsaI线性化；c)连接，将退火产物连接到经过BsaI线性化的pUC57-sgRNA表达载体上，连接的载体通过转化、挑菌和鉴定后，对阳性克隆摇菌提取质粒并测定浓度；d)PCR扩增，所用正向引物的序列为：TCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGG，所用反向引物的序列为：AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTC；e)体外转录，利用T7转录试剂盒将sgRNA的DNA体外转录为RNA，凝胶电泳鉴定后用RNA回收。与现有技术相比，本专利技术具有如下显著性有益效果：本专利技术的研究结果显示：采用本专利技术所述方法可实现对NK细胞中CD96基因的敲除效率达到23％，不仅敲除效率较高，而且所获得的不表达CD96的NK细胞可解除CD155+肿瘤细胞对NK细胞的免疫抑制作用，相对于野生型NK细胞，在体内、体外实验中均展现出更强的抗肿瘤活性，明显提高了NK细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤活性，可望开发成安全有效的抗肿瘤生物制剂，具有明显的应用前景和临床应用价值，对过继免疫治疗肿瘤及病毒感染性疾病(例如HIV/AIDS、新型冠状病毒肺炎/COVID-19)具有重要意义。附图说明图1体现了CM137和EN138两种程序电转后NK细胞的活细胞百分比的对比情况，其中的control组为未经电转的NK细胞；图2A体现了采用CM137程序电转不同的sgRNA/Cas9蛋白复合物后NK细胞的活细胞百分比的对比情况，其中的WT组为仅电转Cas9蛋白但未电转sgRNA的NK细胞；图2B显示了电转靶向CD96的不同sgRNA后对CD96基因的敲除效率对比，其中的CD56是人NK细胞的表面标志物，WT组为仅电转Cas9蛋白但未电转sgRNA的NK细胞；图3显示了电转靶向CD96的未经修饰的和经磷酸化修饰的sgRNA-10序列后，对CD96基因的敲除效率对比，其中的CD56是人NK细胞的表面标志物，WT组为仅电转Cas9蛋白但未电转sgRNA的NK细胞；图4体现了敲除CD96基因后的NK细胞以及野生型NK细胞对H1975肺癌、HCT8结直肠癌、PC3前列腺癌、LM7骨肉瘤、HepG2肝癌、A375和色素瘤、MDA-MB-231乳腺癌、K562白血病细胞的体外杀伤活性对比；图5体现了敲除CD96基因后的NK细胞以及野生型NK细胞，与H1975肺癌细胞或HepG2肝癌细胞体外共培养时NK细胞的脱颗粒水平对比；图6A体现了敲除CD96基因后的NK细胞以及野生型NK细胞过继免疫治疗对肺癌荷瘤小鼠肿瘤生长的控制情况对比；图6B体现了不同类型NK细胞过继免疫治疗对荷瘤小鼠体重的影响。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例1一种高效敲除NK细胞中CD96基因的方法，包括如下具体步骤：一、NK细胞的扩增和培养1)从液氮中取出冻存的人外周血单个核细胞(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效敲除NK细胞中CD96基因的方法，其特征在于：所述方法是利用CRISPR/Cas9基因编辑系统，以电穿孔转染方式将sgRNA与Cas9蛋白的复合物导入经扩增的NK细胞中，其中：sgRNA的序列选自SEQ ID NO.1～10所示序列中的任意一种。/n

【技术特征摘要】
1.一种高效敲除NK细胞中CD96基因的方法，其特征在于：所述方法是利用CRISPR/Cas9基因编辑系统，以电穿孔转染方式将sgRNA与Cas9蛋白的复合物导入经扩增的NK细胞中，其中：sgRNA的序列选自SEQIDNO.1～10所示序列中的任意一种。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：sgRNA的序列选自SEQIDNO.5或9或10所示序列。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述复合物中，sgRNA与Cas9蛋白的质量比为1:(3～5)。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述sgRNA经过磷酸化修饰。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：进行磷酸化修饰的位点为：3'端和5'端各3个硫代基和甲氧基。


6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述Cas9蛋白先经过大肠杆菌密码子优化，然后构建到Pet28a表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱诗国，姚超，于文霞，
申请(专利权)人：上海中医药大学，
类型：发明
国别省市：上海;31