一种CAR-T细胞的复苏方法技术

本发明专利技术公开一种CAR‑T细胞的复苏方法，包括以下步骤：液氮中取出装有CAR‑T细胞及冻存液的冻存袋，加入36～40℃预热的复苏液，冻存袋于36～40℃水浴条件下1～2min摇晃化冻，离心，弃上清；加入36～40℃预热的复苏液混合，离心，弃上清，用细胞培养基重悬细胞；所述复苏液包括以下成分：L‑脯氨酸10～50μg/L、亚硒酸钠10‑100mg/L、丙酮酸钠2.0～2.2mg/L、NaOH 0.2～0.5mg/L、氯化镁0.2～0.4mg/L、黄芪甲苷15～25mg/L、白术内酯Ⅱ10～50mg/L、泛影酸钠15～30mg/L，余量是细胞培养基。采用本发明专利技术复苏方法，能够很好的保持细胞的活率、增殖能力和清除肿瘤细胞的能力。且该法操作简便，成本较低，利于产业化使用。

【技术实现步骤摘要】
一种CAR-T细胞的复苏方法
本专利技术涉及CAR-T细胞
，具体涉及一种CAR-T细胞的复苏方法。
技术介绍
CAR-T细胞是将人工设计的外源性嵌合抗原受体(CAR)导入到T细胞内后得到的一种改造过的T细胞。CAR-T细胞因在白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、脑胶质瘤等恶性肿瘤治疗中表现出良好的治疗效果而备受关注。在CAR-T细胞的应用过程中，由于细胞制剂制备周期、治疗时机等因素的影响，常常需要对其进行液氮冻存，使用时对其进行复苏。对冻存细胞复苏时，通常是将冻存管或冻存袋直接置于37℃迅速解冻，再加入完全生长培养基重悬细胞，离心后弃去上清，加入培养基继续培养。本研究前期对CAR-T细胞的冻存方法进行改良，使用由泊洛沙姆、西兰花多糖、瓜儿豆蛋白等成分构成的冻存液进行冻存。泊洛沙姆、西兰花多糖、瓜儿豆蛋白等形成的网络结构，具有良好的CAR-T细胞保护作用，避免CAR-T细胞在液氮长期冻存过程中被损伤。但研究过程中发现，使用该冻存液后，若采用常规的复苏方法，仍然不能使冻存后的细胞达到最佳的增殖能力和清除肿瘤细胞的能力。鉴于此，有必要对CAR-T细胞的复苏方法进一步进行改良。
技术实现思路
为进一步提高CAR-T细胞复苏后的增殖能力和清除肿瘤细胞的能力，本专利技术提供一种改良后的CAR-T细胞复苏方法。本专利技术方案包括以下方面：一种CAR-T细胞的复苏方法，包括以下步骤：液氮中取出装有CAR-T细胞及冻存液的冻存袋，加入36～40℃预热的复苏液，冻存袋于36～40℃水浴条件下1～2min摇晃化冻，离心，弃上清；加入36～40℃预热的复苏液混合，离心，弃上清，用细胞培养基重悬细胞；所述复苏液包括以下成分：L-脯氨酸10～50μg/L、亚硒酸钠10～100mg/L、丙酮酸钠2.0～2.2mg/L、NaOH0.2～0.5mg/L、氯化镁0.2～0.4mg/L、黄芪甲苷15～25mg/L、白术内酯Ⅱ10～50mg/L、泛影酸钠15～30mg/L，余量是细胞培养基。优选的，两次复苏液的加入量均为细胞冻存液的2～3倍体积。优选的，离心参数为500～600rpm离心1～2min。优选的，所述细胞培养基为RPMI-1640培养基。优选的，所述复苏液包括以下成分：L-脯氨酸25μg/L、亚硒酸钠50mg/L、丙酮酸钠2.2mg/L、NaOH0.5mg/L、氯化镁0.4mg/L、黄芪甲苷20mg/L、白术内酯Ⅱ25mg/L、泛影酸钠18mg/L，余量是细胞培养基。另一方面，本专利技术提供一种CAR-T细胞复苏液，该复苏液包括以下成分：L-脯氨酸10～50μg/L、亚硒酸钠10～100mg/L、丙酮酸钠2.0～2.2mg/L、NaOH0.2～0.5mg/L、氯化镁0.2～0.4mg/L、黄芪甲苷15～25mg/L、白术内酯Ⅱ10～50mg/L、泛影酸钠15～30mg/L，余量是细胞培养基。优选的，所述CAR-T细胞复苏液包括以下成分：L-脯氨酸25μg/L、亚硒酸钠50mg/L、丙酮酸钠2.2mg/L、NaOH0.5mg/L、氯化镁0.4mg/L、黄芪甲苷20mg/L、白术内酯Ⅱ25mg/L、泛影酸钠18mg/L，余量是细胞培养基。本专利技术所取得的有益效果：本专利技术提出一种新的CAR-T细胞复苏方法，主要基于前期使用的冻存液的性质进行复苏方法的改进，对复苏液使用时机及复苏液成分进行优化。采用本专利技术复苏方法，能够很好的保持细胞的活率、增殖能力和清除肿瘤细胞的能力。高速离心可能导致局部的温度变化，从而影响到CAR-T细胞的活力，进而影响CAR-T细胞的功效。采用本专利技术的复苏方法，仅需在500～600rpm条件下离心1～2min，不仅降低了复苏过程中高速离心对细胞产生的二次损伤。本专利技术所提供的复苏方法，操作简便，成本较低，利于产业化使用。附图说明图1：细胞增殖效果检测结果统计图。具体实施方式为了更好理解本专利技术
技术实现思路
，下面提供具体实施例，对本专利技术做进一步的说明。本专利技术实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。本专利技术实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1一种CAR-T细胞的复苏方法，包括以下步骤：液氮中取出装有CAR-T细胞及冻存液的冻存袋，加入36～40℃预热的复苏液，冻存袋于36～40℃水浴条件下1～2min摇晃化冻，500rpm离心1～2min，弃上清；加入36～40℃预热的复苏液，500rpm离心1～2min，弃上清，用RPMI-1640培养基重悬细胞；其中，两次复苏液的加入量均为细胞冻存液的2～3倍体积。所述复苏液包括以下成分：L-脯氨酸50μg/L、亚硒酸钠10mg/L、丙酮酸钠2.2mg/L、NaOH0.2mg/L、氯化镁0.2mg/L、黄芪甲苷25mg/L、白术内酯Ⅱ10mg/L、泛影酸钠30mg/L，余量是RPMI-1640培养基。实施例2一种CAR-T细胞的复苏方法，包括以下步骤：液氮中取出装有CAR-T细胞及冻存液的冻存袋，加入36～40℃预热的复苏液，冻存袋于36～40℃水浴条件下1～2min摇晃化冻，600rpm离心1～2min，弃上清；加入36～40℃预热的复苏液，600rpm离心1～2min，弃上清，用RPMI-1640培养基重悬细胞；其中，两次复苏液的加入量均为细胞冻存液的2～3倍体积。所述复苏液包括以下成分：L-脯氨酸50μg/L、亚硒酸钠10mg/L、丙酮酸钠2.2mg/L、NaOH0.2mg/L、氯化镁0.2mg/L、黄芪甲苷25mg/L、白术内酯Ⅱ10mg/L、泛影酸钠30mg/L，余量是RPMI-1640培养基。实施例3本例与实施例1的区别是：所述复苏液包括以下成分：L-脯氨酸25μg/L、亚硒酸钠50mg/L、丙酮酸钠2.2mg/L、NaOH0.5mg/L、氯化镁0.4mg/L、黄芪甲苷20mg/L、白术内酯Ⅱ25mg/L、泛影酸钠18mg/L，余量是RPMI-1640培养基。实施例4本例与实施例1的区别是：所述复苏液包括以下成分：L-脯氨酸10μg/L、亚硒酸钠100mg/L、丙酮酸钠2.0mg/L、NaOH0.5mg/L、氯化镁0.4mg/L、黄芪甲苷15mg/L、白术内酯Ⅱ50mg/L、泛影酸钠15mg/L，余量是RPMI-1640培养基。实施例5本例与实施例1的区别是：离心参数是：1500rpm离心10min。对比例1本例与实施例1的区别是：一种CAR-T细胞的复苏方法，包括以下步骤：液氮中取出装有CAR-T细胞及冻存液的冻存袋，冻存袋于36～40℃水浴条件下1～2min摇晃化冻，500rpm离心1～2min，弃上清；加入36～40℃预热的复苏液，500rpm离心1～2min，弃上清，用RPMI-1640培养基重悬细胞。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种CAR-T细胞的复苏方法，其特征在于，包括以下步骤：/n液氮中取出装有CAR-T细胞及冻存液的冻存袋，加入36～40℃预热的复苏液，冻存袋于36～40℃水浴条件下1～2min摇晃化冻，离心，弃上清；加入36～40℃预热的复苏液混合，离心，弃上清，用细胞培养基重悬细胞；/n所述复苏液包括以下成分：L-脯氨酸10～50μg/L、亚硒酸钠10～100mg/L、丙酮酸钠2.0～2.2mg/L、NaOH 0.2～0.5mg/L、氯化镁0.2～0.4mg/L、黄芪甲苷15～25mg/L、白术内酯Ⅱ10～50mg/L、泛影酸钠15～30mg/L，余量是细胞培养基。/n

【技术特征摘要】
1.一种CAR-T细胞的复苏方法，其特征在于，包括以下步骤：
液氮中取出装有CAR-T细胞及冻存液的冻存袋，加入36～40℃预热的复苏液，冻存袋于36～40℃水浴条件下1～2min摇晃化冻，离心，弃上清；加入36～40℃预热的复苏液混合，离心，弃上清，用细胞培养基重悬细胞；
所述复苏液包括以下成分：L-脯氨酸10～50μg/L、亚硒酸钠10～100mg/L、丙酮酸钠2.0～2.2mg/L、NaOH0.2～0.5mg/L、氯化镁0.2～0.4mg/L、黄芪甲苷15～25mg/L、白术内酯Ⅱ10～50mg/L、泛影酸钠15～30mg/L，余量是细胞培养基。


2.根据权利要求1所述的CAR-T细胞冻存方法，其特征在于，两次复苏液的加入量均为细胞冻存液的2～3倍体积。


3.根据权利要求1所述的CAR-T细胞冻存方法，其特征在于，离心参数为500～600rpm离心1～2min。


4.根据权利要求1所述的CAR-T细胞冻存方法，其特征在于，所述细胞培养基为RPMI-1640...

【专利技术属性】
技术研发人员：湛振键，齐国光，刘世豪，
申请(专利权)人：广东康盾生物工程技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44