一种细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法，该方法为将采集的人外周血样本分离得到PBMNC；将PBMNC接种至被重组人源化抗CD25mAb单克隆抗体包被过的培养瓶中培养；将步骤S2得到的未贴壁细胞和培养上清一起转移至被重组人源化抗CD3ε单克隆抗体包被过的培养瓶中，补充INF‑γ继续培养。本发明专利技术的细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法通过采用CD25单抗改良CIK细胞传统培养工艺诱导、扩增CIK细胞，从而提高CD3+CD56+细胞得率，降低CD3+CD4+细胞比例，有效提高CIK细胞对K562和SK‑MEL‑5细胞的杀伤潜能，对制定临床级CIK细胞制剂的制备方法和质量标准有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法
本专利技术涉及免疫细胞制备
，具体来说，涉及一种细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法。
技术介绍
1991年SchmidtWolf等发现以INF-γ、anti-CD3Mab、IL-1a、IL-2因子组合分步诱导、扩增PBMNC，能获得一群以CD3+CD56+细胞为效应细胞的高增殖潜能、高杀伤活性的NK样T淋巴细胞，此后国内外大量的试验研究或临床应用所采用的培养体系均与SchmidtWolf等的类似。既往的研究表明，未经分选的PBMNC诱导扩增得到的CIK细胞是高度异质性的，其中包含一群高杀伤活性的、低增殖能力的非MHC限制性的CD3+CD56+细胞和另外一群低杀伤活性的、高增殖能力的CD3+CD56-细胞。我们统计的48个临床研究显示CIK细胞得率大约在2×109～6.1×1010之间，而培养14d的CIK细胞中主要包含CD3-和CD3+两个细胞亚群，其中大约93.8%（77.4~99%）是CD3+细胞，CD4+细胞大约占33.2%（9.2%~41.3%），CD8+细胞约占82%（62.4%~92%），而CD3+CD56+细胞约占35.5%（7.6~65%）。另外的研究也表明，以免疫磁珠分选的方法去除PBMNC中CD4+细胞，经CIK细胞诱导培养能显著提高产物中CD3+CD56+细胞的比例。但免疫磁珠分选不仅成本高，而且操作繁琐、对细胞损伤大、容易污染。因此，如何优化CIK细胞培养体系，提高培养的CIK细胞中高杀伤活性的CD3+CD56+细胞的比例，降低CD4+细胞的比例，可能是现今CIK细胞制剂工艺研发的关键问题。
技术实现思路
针对相关技术中的上述技术问题，本专利技术提出一种细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法，能够克服现有技术的上述不足。为实现上述技术目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：一种细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法，包括以下步骤：S1.将采集的人外周血样本分离得到PBMNC；S2.将PBMNC接种至被重组人源化抗CD25mAb单克隆抗体包被过的培养瓶中培养；S3.将步骤S2得到的未贴壁细胞和培养上清一起转移至被重组人源化抗CD3ε单克隆抗体包被过的培养瓶中，补充INF-γ继续培养。进一步地，步骤S2中所述重组人源化抗CD25mAb单克隆抗体包被培养瓶的方法为：将含10μg/mL重组人源化抗CD25mAb单克隆抗体的GT-T551无血清培养基作为包被液加入到培养瓶中，37℃包被6小时，吸弃包被液，以GT-T551无血清培养基洗涤2次备用。进一步地，步骤S2中PBMNC培养时间为24h。进一步地，步骤S3中所述重组人源化抗CD3ε单克隆抗体包被培养瓶的方法为：将含重组人源化抗10μg/mLCD3ε单克隆抗体、50μg/mLNovoNectin的GT-T551无血清培养基作为包被液加入到培养瓶中，37℃包被6小时，吸弃包被液，以GT-T551无血清培养基洗涤2次备用。进一步地，步骤S3中补充INF-γ继续培养24h后，补充重组人IL-2、IL-1a，继续培养48h，补充CIK细胞扩增培养基继续培养。进一步地，补充CIK细胞扩增培养基继续培养过程中每隔48h补充一次CIK细胞扩增培养基。进一步地，所述CIK细胞扩增培养基为含500Μ/mL重组人IL-2、2%灭活血浆的GT-T551无血清培养基。进一步地，步骤S2中接种至培养瓶的PBMNC的细胞密度不低于5X105/mL。进一步地，步骤S1中采用密度梯度离心法分离PBMNC。进一步地，PBMNC在37℃，5%CO2，饱和湿度培养。本专利技术的有益效果：本专利技术的细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法通过采用CD25单抗改良CIK细胞传统培养工艺诱导、扩增CIK细胞，从而提高CD3+CD56+细胞得率，降低CD3+CD4+细胞比例，有效提高CIK细胞对K562和SK-MEL-5细胞的杀伤潜能，对制定临床级CIK细胞制剂的制备方法和质量标准有重要意义。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是根据本专利技术实施例所述的两种培养体系CIK细胞的生长状态对比图；图2是根据本专利技术实施例所述的两种培养体系的有核细胞和CD3+CD56+效应细胞的数量对比图；图3是根据本专利技术实施例所述的两种不同培养体系CIK细胞中淋巴细胞亚群的百分比对比图；图4是根据本专利技术实施例所述的不同效靶比条件下，两种培养体系CIK细胞对K562细胞的杀伤效应对比图；图5是根据本专利技术实施例所述的不同效靶比条件下，两种培养体系CIK细胞对SK-MEL-5细胞的杀伤效应对比图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例11.外周血样本及试剂1.1外周血样本以枸橼酸钠抗凝管经肘正中静脉采集所述9例健康供者外周血，按“采血量（mL）=1X108/每mL外周血淋巴细胞计数”核算，采集的外周血中包含的淋巴细胞总数不得低于3X107。本实施例纳入9名健康供者的外周血样本，男6人，女3人；平均年龄（岁）29.22±5.58（21~42）；采血前血常规检查结果表明LYM#（*109/L）为1.93±0.44（1.08~2.82）；平均采血量（mL）为18.88±3.60（14~27）。1.2试剂枸橼酸钠抗凝管（南格尔生物医学股份有限公司）；人外周血淋巴细胞分离液（LTS1077，天津灏洋生物制品科技有限责任公司）；人源化INF-γ（IFG-H4211，ACRObiosystems）；重组人IL-1a（KX-GMP-023，上海惠诚生物科技有限公司）；GT-T551无血清培养基（TakaraBIO株式会社）；重组抗CD3ε人源化单克隆抗体（MT-OKT3-01，妙通（上海）生物科技有限公司）；NovoNectin（GMP-CH-38，上海近岸科技有限公司）；重组人源化抗CD25mAb单克隆抗体（健尼哌，三生制药）；重组人IL-2（因特康，江苏金丝利药业有限公司）；LDH检测试剂盒（KTB1110，Abbkine）。2.细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法2.1分离PBMNC本专利技术采用密度梯度离心法分离PBMNC：将血液样本从采血管转移至50mL一次性无菌锥形离心管中，400Xg离心20min，升速5，降速1；以一次性无菌嘴叨管小心吸取上层血浆，于56℃水浴中，恒温水浴本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 一种细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 ：/nS1.将采集的人外周血样本分离得到PBMNC；/nS2.将PBMNC接种至被重组人源化抗CD25mAb单克隆抗体包被过的培养瓶中培养；/nS3.将步骤S2得到的未贴壁细胞和培养上清一起转移至被重组人源化抗CD3ε单克隆抗体包被过的培养瓶中，补充INF-γ继续培养。/n

【技术特征摘要】
1.一种细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将采集的人外周血样本分离得到PBMNC；
S2.将PBMNC接种至被重组人源化抗CD25mAb单克隆抗体包被过的培养瓶中培养；
S3.将步骤S2得到的未贴壁细胞和培养上清一起转移至被重组人源化抗CD3ε单克隆抗体包被过的培养瓶中，补充INF-γ继续培养。


2.根据权利要求1所述的细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述重组人源化抗CD25mAb单克隆抗体包被培养瓶的方法为：将含10μg/mL重组人源化抗CD25mAb单克隆抗体的GT-T551无血清培养基作为包被液加入到培养瓶中，37℃包被6小时，吸弃包被液，以GT-T551无血清培养基洗涤2次备用。


3.根据权利要求1所述的细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法，其特征在于，步骤S2中PBMNC培养时间为24h。


4.根据权利要求1所述的细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述重组人源化抗CD3ε单克隆抗体包被培养瓶的方法为：将含重组人源化抗10μg/mLCD3ε单克隆抗体、50μg/mLNovoNectin的GT-T551无血清培养基作为包被液加入到...

【专利技术属性】
技术研发人员：苑春慧，陈革，
申请(专利权)人：北广再生医学科技广东有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44