iPS细胞定向分化为NK细胞的方法技术

本发明专利技术提供了一种iPS细胞定向诱导分化为NK细胞的方法，包括：在第一、第二、第三培养皿中用第一培养基培养OP9‑DL1细胞；将iPS细胞用第一培养基重悬后，在细胞悬液加入1Vol‰的Y‑27632，加入第一培养皿，共同培养OP9‑DL1细胞和iPS细胞；收集共同培养后的培养液，对共同培养的细胞进行消化，将培养液和消化后的细胞悬液共同离心，用第二培养基重悬细胞沉淀后，将细胞悬液转移到第二培养皿中培养；进一步收集共同培养后的培养液，对共同培养的细胞进行消化，将培养液和消化后的细胞悬液共同离心，用第二培养基重悬细胞沉淀后，将细胞悬液转移到含有OP9‑DL1细胞的第三培养皿中培养。本发明专利技术的方法可以提高iPS细胞定向诱导分化为NK细胞的分化效率，高效地获取大量的NK细胞。

【技术实现步骤摘要】
iPS细胞定向分化为NK细胞的方法
本专利技术涉及干细胞生物学与再生医学领域，具体地涉及一种iPS细胞定向诱导分化为NK细胞的方法。
技术介绍
NK细胞(自然杀伤细胞)是一种大颗粒的固有免疫细胞，是淋巴细胞中被发现较晚的独特细胞群体，可直接识别和杀伤病毒感染的以及癌变的细胞，在过继转输治疗应用中有很大的前景。随着细胞免疫治疗的兴起，NK细胞越来越为人们所重视。然而，足够的NK细胞数量及强大的杀伤功能是目前NK细胞应用的限制因素。由于人体自身NK细胞数量有限，而且在NK细胞不同发育阶段，甚至同一发育阶段的不同组织中，NK细胞的表型和功能都存在很大的差异，这些都严重限制了NK细胞在临床上大规模运用。因此，从原代NK细胞扩增或由干细胞分化扩增获得足够数量的杀伤性较强的NK细胞是促进NK细胞临床应用及提高治疗疗效的前提。在适宜的条件下，干细胞可以在体内和体外分化为NK细胞。在NK细胞的发育过程中，干细胞首先可以发育为共同淋巴细胞前体(CLPs)和共同髓系细胞前体(CMPs)；随后，CLPs进一步引起T、B以及NK细胞前体(NKP)的产生，NKP可以进一步特异性地生成NK细胞。干细胞可以分化为多种不同的细胞类型，其分化方向受到多种外部信号的影响，外部信号通过促进特定的分化通路影响相应细胞的分化。因此，通过外部信号促进其向CLPs方向分化，才能获得更多的NK细胞。诱导多潜能干细胞(inducedpluripotentstemcells,iPS细胞)可以在适当条件下,在体外分化成含各个胚层来源的拟胚体(embryoidbody,EB),并进一步分化为治疗相关的功能细胞,如胰岛素分泌细胞、造血细胞、神经细胞等。由于iPS细胞直接由患者的体细胞重编程而来,所以在进行细胞移植的时候不存在免疫排斥,且不用考虑细胞来源的伦理问题，因此,具有广阔的临床应用前景。iPS细胞的出现解决了ES细胞伦理问题的困扰,其应用价值令人期待,但在应用于人体细胞移植或药物研究领域还面临很多问题有待解决。例如，iPS细胞的再分化机制还不明确,人类仍不能按照自己的意愿将其定向分化为所需的细胞。因此,需要进一步深入研究iPS细胞定向分化的分机理和提高iPS细胞的分化效率,高效地获得所需的功能性细胞；如何确保分化后的功能细胞移植后能稳定地发挥功效。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的局限，提供一种由iPS细胞定向诱导分化为NK细胞的方法，提高NK细胞的分化效率，高效地获取大量的NK细胞。本专利技术的技术方案如下：(1)在第一培养皿、第二培养皿、第三培养皿中用第一培养基培养OP9-DL1细胞；(2)将iPS细胞用新鲜的第一培养基重悬后，在细胞悬液加入1Vol‰的Y-27632，吸掉第一培养皿中的第一培养基，加入细胞悬液，共同培养OP9-DL1细胞和iPS细胞；(3)收集步骤(2)中共同培养后的培养液，且对共同培养的细胞进行消化，消化终止后进行离心、重悬和静置；将培养液和静置后的细胞悬液共同离心，收集细胞沉淀，用第二培养基重悬细胞沉淀后，吸掉第二培养皿中的第一培养基，将细胞悬液转移到含有OP9-DL1细胞的第二培养皿中培养；第二培养基为含有以下组分的αMEM培养基:20Vol％FBS(胎牛血清)；1Vol％P/S(青霉素和链霉素)；10ng/mLSCF(干细胞因子，STemCellFactor)；5ng/mLFLT3L(Fms-liketyrosinekinase,FMS样的酪氨酸激酶3)；5ng/mLIL-7(白细胞介素-7)；10ng/mLIL-15(白细胞介素-15)；(4)收集步骤(3)中共同培养后的培养液，对共同培养的细胞进行消化，消化终止后进行离心、重悬和静置；将培养液和静置后的细胞悬液共同离心，收集细胞沉淀，用第二培养基重悬细胞沉淀后，吸掉第三培养皿中的第一培养基，将细胞悬液转移到含有OP9-DL1细胞的第三培养皿中培养。OP9细胞是小鼠骨髓的基质细胞，用Notch配体分子DL1(Delta-like1)的逆转录病毒表达载体转染OP9细胞，得到稳定表达DL1分子的OP9-DL1细胞。DL1分子在OP9基质细胞表面的过表达可以提供了NK细胞定向分化所需的Notch信号，可高效诱导NK细胞的体外生成。OP9-DL1细胞可使与其共培养的iPS细胞发生大量扩增(1000～4000倍)，并按正常的发育程序分化为功能完全成熟的NK细胞。本专利技术经过多次将iPS细胞与OP9-DL1细胞共培养，且加入不同的外部信号诱导因子，使得iPS细胞分化为NK细胞的效率大大地提高。iPS是贴壁生长的，但是在诱导成NK细胞之后是悬浮的，在中间过程可能有一些悬浮，有一些还贴壁。所以，除了收集共同培养的培养液，同时也要把贴壁的iPS细胞消化下来。这个消化过程没办法保证只消化iPS细胞，需要在消化下来之后，用第一培养基重悬放培养皿静置40min，让OP9-DL1细胞贴壁；短时间内iPS细胞不容易贴壁，从而分离。作为上述技术方案的进一步改进，其中所述步骤(4)重复2～3次。作为上述技术方案的进一步改进，步骤(2)中共同培养时间为7～10天，中途更换1～2次培养液。作为上述技术方案的进一步改进，步骤(3)中培养时间为12～16天，每3～4天更换培养液。作为上述技术方案的进一步改进，步骤(4)中培养时间为12～16天，每3～4天更换培养液。作为上述技术方案的进一步改进，步骤(3)和步骤(4)中均采用IV型胶原酶进行消化，且离心条件为300rcf，5min。作为上述技术方案的进一步改进，步骤(1)中第一培养皿、第二培养皿和第三培养皿均加入0.1％的明胶进行预处理，OP9-DL1细胞生长在明胶上。作为上述技术方案的进一步改进，步骤(1)中第一培养基为含有为以下组分的αMEM培养基:20Vol％FBS；1Vol％P/S。另一方面，本专利技术还提供了一种采用上述方法制备的NK细胞。另一方面，本专利技术还提供了上述NK细胞在制备用于治疗病毒感染和/或癌症的药物/生物制品中的应用。本专利技术的方法简单高效，安全性高，利用本专利技术方法，可成功高效的获得具有生物学活性及功能的NK细胞，且让iPS细胞向NK细胞分化的比例明显提高。同时，本专利技术的方法可以大规模生产高品质的NK细胞，无需后续的筛选和纯化步骤，可以直接用于NK细胞相关的科学研究，相关疾病的细胞治疗，细胞移植以及药物筛选的应用需求。附图说明图1为未分化的iPS细胞的显微镜图片。图2为iPS细胞定向诱导分化而成的NK细胞。具体实施方式为更好的说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。在本专利技术中，本文使用的术语“分化”指的是在体外培养时，在控制条件下，通过非特化本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种iPS细胞定向诱导分化为NK细胞的方法，所述方法包括以下步骤：/n(1)在第一培养皿、第二培养皿、第三培养皿中用第一培养基培养OP9-DL1细胞；/n(2)将iPS细胞用新鲜的第一培养基重悬后，在细胞悬液加入1Vol‰的Y-27632，吸掉第一培养皿中的第一培养基，加入细胞悬液，共同培养OP9-DL1细胞和iPS细胞；/n(3)收集步骤(2)中共同培养后的培养液，且对共同培养的细胞进行消化，消化终止后进行离心、重悬和静置；将培养液和静置后的细胞悬液共同离心，收集细胞沉淀，用第二培养基重悬细胞沉淀后，吸掉第二培养皿中的第一培养基，将细胞悬液转移到含有OP9-DL1细胞的第二培养皿中培养；/n第二培养基为含有以下组分的αMEM培养基:/n20Vol％FBS；/n1Vol％P/S；/n10ng/mL SCF；/n5ng/mL FLT3L；/n5ng/mL IL-7；/n10ng/mL IL-15；/n(4)收集步骤(3)中共同培养后的培养液，对共同培养的细胞进行消化，消化终止后进行离心、重悬和静置；将培养液和静置后的细胞悬液共同离心，收集细胞沉淀，用第二培养基重悬细胞沉淀后，吸掉第三培养皿中的第一培养基，将细胞悬液转移到含有OP9-DL1细胞的第三培养皿中培养。/n...

【技术特征摘要】
1.一种iPS细胞定向诱导分化为NK细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)在第一培养皿、第二培养皿、第三培养皿中用第一培养基培养OP9-DL1细胞；
(2)将iPS细胞用新鲜的第一培养基重悬后，在细胞悬液加入1Vol‰的Y-27632，吸掉第一培养皿中的第一培养基，加入细胞悬液，共同培养OP9-DL1细胞和iPS细胞；
(3)收集步骤(2)中共同培养后的培养液，且对共同培养的细胞进行消化，消化终止后进行离心、重悬和静置；将培养液和静置后的细胞悬液共同离心，收集细胞沉淀，用第二培养基重悬细胞沉淀后，吸掉第二培养皿中的第一培养基，将细胞悬液转移到含有OP9-DL1细胞的第二培养皿中培养；
第二培养基为含有以下组分的αMEM培养基:
20Vol％FBS；
1Vol％P/S；
10ng/mLSCF；
5ng/mLFLT3L；
5ng/mLIL-7；
10ng/mLIL-15；
(4)收集步骤(3)中共同培养后的培养液，对共同培养的细胞进行消化，消化终止后进行离心、重悬和静置；将培养液和静置后的细胞悬液共同离心，收集细胞沉淀，用第二培养基重悬细胞沉淀后，吸掉第三培养皿中的第一培养基，将细胞悬液转移到含有OP9-DL1细胞的第三培养皿中培养。


2.如权利要求1所述的iPS细胞定向诱导分化为NK细胞的方法，其中所述步骤(4)重复2～3...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾皓宇，李羽妹，蒋碧愉，覃洁萍，卜粤芬，李莲，
申请(专利权)人：广东普罗凯融生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44