一种过表达CD16a的NK细胞的制备方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种制备过表达CD16a的NK细胞的方法，包括以下步骤：(1)构建具有CD16a的目标质粒的慢病毒转染体系；(2)培养HEK 293T细胞；(3)将转染试剂和质粒混均；(5)进行慢病毒包装；(6)收集、过滤和浓缩病毒液；(7)转染第二细胞培养基重悬的NK细胞，加入聚凝胺，预热；(8)离心；(9)加入含有聚凝胺的第二细胞培养基，混匀，采用第三细胞培养基继续培养；(11)取细胞做流式检测阳性率，做流式分选，筛选出阳性细胞，接种相应体系继续扩增培养并建库。采用本发明专利技术方法制备的过表达CD16a的NK细胞阳性率高和细胞存活率高，且使得NK细胞多次传代后依然能够稳定过表达CD16a，对于癌细胞具有良好的杀伤性能。好的杀伤性能。

A preparation method of NK cells overexpressing cd16a and its application

【技术实现步骤摘要】
一种过表达CD16a的NK细胞的制备方法及其应用


[0001]本专利技术属于细胞免疫治疗领域，具体地，涉及一种过表达CD16a的NK细胞的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]抗体依赖的细胞毒性(antibody
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dependent cell mediatedcytotoxicity，ADCC)作用是指具有杀伤活力的免疫细胞，通过细胞表面的FC受体和单克隆抗体结合，识别被单克隆抗体结合的靶抗原(如细菌或者肿瘤细胞)，直接杀伤靶细胞。研究发现，ADCC作用是单克隆抗体治疗肿瘤或其他疾病的重要机制和手段之一。
[0003]介导ADCC作用的免疫细胞及其受体:机体发挥ADCC作用的免疫细胞主要包括单核白细胞(如自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞和γδT细胞)与多形核细胞(中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞)。其中，NK细胞是介导ADCC作用的主要细胞，比单核细胞、中性粒细胞和巨噬细胞等细胞介导的ADCC作用要强。
[0004]FcγRⅢa(CD16a)属于免疫球蛋白的超家族成员，为低亲和力的IgG受体，是一种表达于自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、肥大细胞和中性粒细胞等免疫效应细胞表面的跨膜蛋白，是机体细胞免疫功能发挥作用的一个比较重要的结合位点。CD16a与人IgG1和IgG3的Fc段结合，诱导免疫效应细胞(主要是NK细胞)的细胞毒作用
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即抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)杀伤靶细胞，也可直接介导NK细胞对肿瘤靶细胞的杀伤作用；还可促进IFN/>‑
γ、TNF和基质金属蛋白酶等细胞因子的分泌，影响细胞免疫功能发挥。以ADCC为作用基础的单克隆抗体介导分子靶向治疗在恶性肿瘤中应用越来越广泛，作为结合位点的CD16a越来越受到关注。
[0005]曾有人设想通过基因转移技术在NK细胞的表面过表达CD16a，以增加NK细胞的细胞毒作用
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即抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)或增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。
[0006]基因转移技术主要包括病毒方法与电转方法。电转是通过瞬时向细胞或组织施加一定的高电场脉冲，在细胞膜表面瞬时形成通透，进而导致带电荷的分子进入细胞。基于电穿孔的转基因操作中，外源DNA通过可逆的电穿孔被引入胞内，外源基因在其新的宿主细胞内表达，并随着细胞分裂而被遗传。用电转的方法结合能够诱导稳定表达转基因的非病毒基因修饰系统。电转具有操作简单、免疫源性和基因毒性低、安全风险低的优势，但其存在的问题也比较明显：在于瞬时高电压下容易造成细胞的过量死亡，且转染效率低，具体地与细胞类型及电转条件有关。
[0007]病毒方法主要包括使用逆转录病毒载体或慢病毒载体来表达基因，通过包装的病毒颗粒将基因导入免疫效应细胞内，并通过逆转录病毒或慢病毒自身的整合系统整合至细胞基因组上。病毒载体系统的转染效率高低也与细胞类型和具体的转染过程有关。因此目前仍需要一种能够提高免疫效应细胞，尤其是NK细胞，在病毒转染后存活率、稳定性和功能性(例如，杀伤作用)的方法。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于提供一种制备过表达CD16a的NK细胞的方法，以有效提高NK细胞的存活率，CD16a的过表达效率，增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤效果，或者增强NK细胞的细胞毒作用
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即抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)。
[0009]根据本专利技术的一个方面，提供一种制备过表达CD16a的NK细胞的方法，包括以下步骤：
[0010](1)构建具有CD16a的目标质粒和包装质粒的慢病毒转染体系；
[0011](2)培养用于慢病毒的HEK 293T细胞，对所述HEK 293T细胞进行饥饿处理(HEK293T细胞为人胚肾细胞，可以商业化购买)；
[0012](3)将减血清培养基或者无血清培养基平均分成两份，一份加入具有CD16a的目标质粒、第一包装质粒和第二包装质粒的慢病毒转染体系，混合均匀，得到质粒混合物；另一份加入聚乙烯亚胺，混合均匀，然后室温放置1～10min，得到转染试剂；
[0013](4)将转染试剂逐滴加入质粒混合物中，混合均匀后，室温放置5～40min，得到含有聚乙烯亚胺和质粒的混合溶液；
[0014](5)将步骤(4)得到的混合溶液逐滴加入到含有HEK 293T细胞的培养瓶上清中，充分混匀，并放入培养箱中培养6～9h，吸弃上清，加入含有0.1
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5vol％胎牛血清的细胞培养基，继续培养；
[0015](6)每隔24h收集一次病毒转染后的上清，共收取1～3次；
[0016](7)过滤和浓缩病毒液；
[0017](8)取第一细胞培养基重悬培养好的NK细胞，按Moi＝5～100加入浓缩后慢病毒液，再加入聚凝胺，预热；
[0018](9)离心；
[0019](10)加入含有聚凝胺的第二细胞培养基，混匀，继续培养，培养期间根据培养基颜色和细胞数量判断是否半换液或传代，培养期间采用第三细胞培养基。
[0020](11)当细胞传代至起始数10倍以上时，取细胞做流式检测阳性率；当细胞生长至5
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106万个细胞左右时，做流式分选，筛选出阳性细胞，接种相应体系继续扩增培养并建库。
[0021]本专利技术的制备方法采用了精细化配置的多种培养基，第一培养基、第二培养基、第三培养基，结合其所采用的聚乙烯亚胺转染试剂、聚凝胺助感染剂，以及特定的操作方式，有效提高了NK细胞的存活率和CD16a的过表达效率，且使得NK细胞多次传代后依然能够稳定过表达CD16a，增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。
[0022]优选的，其中第一包装质粒为psPAX2质粒，第二包装质粒为pMD2.G质粒，且pMD2.G、psPAX2、具有CD16a的目标质粒三者的质量比为(1～3):(1～5):(2～8)。psPAX2和pMD2.G分别编码HIV
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1gag
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pol和水疱性口炎病毒糖蛋白(VSV
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G，pMD2.G质粒是包膜质粒，能感染更广泛的细胞类型，psPAX2质粒是包装质粒，减少重组病毒自我复制能力，提升使用的安全性。使得三者的质量比在(1～3):(1～5):(2～8)范围内，可以有效提高整个慢病毒转染体系的包装效率，为之后实现较高的NK细胞转染阳性率做好前期准备。
[0023]优选的，包装质粒包括第一包装质粒、第二包装质粒和第三包装质粒，第一包装质粒为pLP1质粒，第二包装质粒为pLP2质粒，第三包装质粒为pLP/VSVG质粒，且具有CD16a的
目标质粒为插入pLenti的表达载体；其中pLP1质粒、、pLP2质粒，、pLP/VSVG质粒、具有CD16a的目标质粒四者的重量比为1.5～7.5:1.2～5.8:3.2～9.3:6.8～10。插入pLenti的表达载体，用于插入CD16a基因，上面包括ψ包装信号以及截本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备过表达CD16a的NK细胞的方法，包括以下步骤：(1)构建具有CD16a的目标质粒和包装质粒的慢病毒转染体系；(2)培养用于慢病毒的HEK 293T细胞，对所述HEK 293T细胞进行饥饿处理；(3)将减血清培养基或者无血清培养基平均分成两份，一份加入具有CD16a的目标质粒、第一包装质粒和第二包装质粒的慢病毒转染体系，混合均匀，得到质粒混合物；另一份加入聚乙烯亚胺，混合均匀，然后室温放置1～10min，得到转染试剂；(4)将转染试剂逐滴加入质粒混合物中，混合均匀后，室温放置5～40min，得到含有聚乙烯亚胺和质粒的混合溶液；(5)将步骤(4)得到的混合溶液逐滴加入到含有HEK 293T细胞的培养瓶上清中，充分混匀，并放入培养箱中培养6～9h，吸弃上清，加入含有0.1
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5vol％胎牛血清的细胞培养基，继续培养；(6)每隔24h收集一次病毒转染后的上清，共收取1～3次；(7)过滤和浓缩病毒液；(8)取第一细胞培养基重悬培养好的NK细胞，按Moi＝5～100加入浓缩后慢病毒液，再加入聚凝胺，预热；(9)离心；(10)加入含有聚凝胺的第二细胞培养基，混匀，继续培养，培养期间根据培养基颜色和细胞数量判断是否半换液或传代，培养期间采用第三细胞培养基。(11)当细胞传代至起始数10倍以上时，取细胞做流式检测阳性率；当细胞生长至5
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106万个细胞左右时，做流式分选，筛选出阳性细胞，接种相应体系继续扩增培养并建库。2.如权利要求1所述的制备过表达CD16a的NK细胞的方法，其中包装质粒包括第一包装质粒和第二包装质粒，其中第一包装质粒为psPAX2质粒，第二包装质粒为pMD2.G质粒，且pMD2.G、psPAX2、具有CD16a的目标质粒三者的质量比为1～3:1～5:2～8；或者，其中包装质粒包括第一包装质粒、第二包装质粒和第三包装质粒，第一包装质粒为pLP1质粒，第二包装质粒为pLP2质粒，第三包装质粒为pLP/VSVG质粒，且具有CD16a的目标质粒为插入pLenti...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾皓宇，沈振波，蒋碧愉，卫佳琦，刘康志，
申请(专利权)人：广东普罗凯融生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：