一种将IPS细胞诱导成NK细胞的试剂盒及其应用方法技术

本发明专利技术提供了一种将IPS细胞诱导为NK细胞的试剂盒，包括第一培养液、第二培养液、第三培养液；第一培养液中含有的干细胞因子、人骨成型蛋白、血管内表皮生长因子，能够有效诱导中胚层的分化，Y

【技术实现步骤摘要】
一种将IPS细胞诱导成NK细胞的试剂盒及其应用方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体地，涉及一种将IPS细胞诱导成NK细胞的试剂盒及其应用方法。

技术介绍

[0002]诱导多潜能干细胞(inducedpluripotentstemcells,IPS细胞)可以在适当条件下，在体外分化成含各个胚层来源的拟胚体(embryoidbody，EB)，并进一步向目标类型细胞进行定向分化，如胰岛素分泌细胞、造血细胞、神经细胞等。由于IPS细胞直接由患者的体细胞重编程而来，所以在进行细胞移植的时候不存在免疫排斥，且不用考虑细胞来源的伦理问题，因此，具有广阔的临床应用前景。
[0003]自然杀伤细胞作为一类独立的淋巴细胞群，无需抗原预先致敏即可直接杀伤靶细胞，包括肿瘤细胞、病毒或细菌感染的细胞以及机体某些衰老正常细胞，因而被视为机体免疫防御系统的第一道防线。随着肿瘤免疫学的发展，越来越多的研究表明，自然杀伤细胞(NK细胞)应用于过继免疫治疗对于消除残留的肿瘤病灶、促进患者免疫系统的重建具有显著的效果，成为了化学治疗和造血干细胞移植后清除残留肿瘤细胞的重要治疗手段。临床NK细胞存在供应不足的情况，目前对NK细胞诱导分化的研究包括细胞共培养技术或添加培养基等方法，但这些方法存在诱导成功的细胞数目少、分化效率低、易受病原污染的缺点。因此，有需要进行进一步研究探索出一种能够将IPS细胞诱导成NK细胞的最佳诱导分化体系。

技术实现思路

[0004]为了解决上述技术问题，本专利技术的目的在于提供一种将IPS细胞诱导成NK细胞的试剂盒及其应用，以期能够开发出一种高效稳定的培养诱导体系和简单易操作的培养方法，获得高数量、高纯度NK细胞。
[0005]根据本专利技术的第一个方面，提供一种将IPS细胞诱导为NK细胞的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：第一培养液、第二培养液、第三培养液；
[0006]第一培养液包括：细胞基础培养基1、1～10mg/mL重组人白蛋白、1～10mg/mL去离子牛血清白蛋白、3～15vol％聚乙烯醇、10～150ng/mL亚油酸、10～150ng/mL亚麻酸、1～10μg/mL合成胆碱、300～500uMα
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硫代甘油、0.1～2vol％胰岛素
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转铁蛋白
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硒
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乙醇胺溶液、2～10vol％无蛋白杂交瘤混合物II、10～100ug/mL2
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磷酸抗坏血酸、5～150ng/m干细胞因子、5～60ng/mL人骨成型蛋白、5～60ng/mL血管内皮生长因子、5～60uMY
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27632；
[0007]第二培养液包括：细胞基础培养2、10～20vol％热灭活的人AB血清、1～10mM L
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谷氨酰胺、0.1～2μMβ
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巯基乙醇、2～8ng/mL亚硒酸钠、10～50μM乙醇胺、10～40mg/L抗坏血酸、5～150ng/mL干细胞因子、5～100ng/mL白细胞介素7、5～100ng/mL白细胞介素15、1～50ng/mL酪氨酸激酶受体3配体。
[0008]第三培养液包括：第二培养液和2～50ng/mL白细胞介素3。
[0009]本专利技术提供了一种将IPS细胞诱导为NK细胞的试剂盒及其应用方法，其中的第一培养液可以将IPS细胞培养形成单细胞团聚拟胚体(Spin EB)，第二培养液和第三培养液可以诱导Spin EB分化为NK细胞。第一培养液不含血清或饲养细胞，培养基成分含量明确可控且不易受到外源性污染，有利于批量生产，实验结果重复性强，可以使IPS细胞高效地形成Spin EB。经过我们的实验研究发现，第一培养液中含有的干细胞因子、人骨成型蛋白、血管内表皮生长因子，能够有效诱导中胚层的分化，Y
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27632能显著减少IPS细胞的凋亡，促进其增殖。这几种成分协同作用能够促进细胞间的信号通路传导加上培养液中的其他营养成分，用于IPS细胞形成Spin EB并有助于Spin EB早期增殖分化为NK细胞。
[0010]我们研究发现，第二培养液和第三培养液中的干细胞因子、白细胞介素7、白细胞介素15和酪氨酸激酶受体3配体(FLT
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3L)联合作用于Spin EB分化为NK细胞的各个阶段。干细胞因子和FLT
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3L能够促进Spin EB的分化，促进NK细胞早期的发育，使之分化为NK祖细胞。干细胞因子、白细胞介素7、白细胞介素15和FLT
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3L联合作用能够促进Spin EB的增殖，进一步使NK细胞的数量增多。白细胞介素7、白细胞介素15能够活化NK细胞，促进NK细胞的快速成熟分化、发育、增殖、提高NK细胞的细胞毒作用及促进NK细胞分泌细胞因子，进而起到免疫调节和杀伤作用。第三培养液中含有的白细胞介素3能够促进NK细胞早期的增殖分化。将第三培养液和第二培养液应用于Spin EB分化的不同阶段，这几种成分成分协同作用，加上培养液中的其他营养成分作用于SpinEB向NK细胞的分化至成熟的各个阶段，有效提高了分化效率，提高了NK细胞的分化成功的比例。
[0011]优选地，第一培养液包括：86.2vol％细胞基础培养基1、1～10mg/mL重组人白蛋白、2～8mg/mL去离子牛血清白蛋白、5～10vol％聚乙烯醇、10～100ng/mL亚油酸、10～100ng/mL亚麻酸、2～8μg/mL合成胆碱、350～450uMα
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硫代甘油、0.1～1vol％胰岛素
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转铁蛋白
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硒
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乙醇胺溶液、2～8vol％无蛋白杂交瘤混合物II、10～100ug/mL2
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磷酸抗坏血酸、30～50ng/m干细胞因子、10～30ng/mL人骨成型蛋白、10～30ng/mL血管内皮生长因子、5～15uMY
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27632；
[0012]第二培养液包括：75％～83vol％细胞基础培养2、10～20vol％热灭活的人AB血清、2mM L
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谷氨酰胺、0.8～1.2μMβ
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巯基乙醇、2～8ng/mL亚硒酸钠、50μM乙醇胺、10～40mg/L抗坏血酸、10～30ng/mL干细胞因子、10～30ng/mL白细胞介素7、5～20ng/mL白细胞介素15、5～20ng/mL酪氨酸激酶受体3配体；
[0013]第三培养液包括：第二培养液和2～8ng/mL白细胞介素3。
[0014]通过进一步限定各培养基中各组分的含量，使本专利技术提供的试剂盒将IPS细胞诱导为NK细胞的效率更高。
[0015]优选地，细胞基础培养基1由以下组分组成：IMDM培养基：F12培养基＝1:1，第一培养液还包括2mM0.5vol％青霉素
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链霉素。
[0016]优选地，细胞基础培养基2由以下组分组成：DMEM培养基：F12培养基＝5～5.5：2.5～2.8，第三培养液还包本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种将IPS细胞诱导为NK细胞的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：第一培养液、第二培养液、第三培养液；所述第一培养液包括：细胞基础培养基1、1～10mg/mL重组人白蛋白、1～10mg/mL去离子牛血清白蛋白、3～15vol％聚乙烯醇、10～150ng/mL亚油酸、10～150ng/mL亚麻酸、1～10μg/mL合成胆碱、300～500uMα
‑
硫代甘油、0.1～2vol％胰岛素
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转铁蛋白
‑
硒
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乙醇胺溶液、2～10vol％无蛋白杂交瘤混合物II、10～100ug/mL2
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磷酸抗坏血酸、5～150ng/mL干细胞因子、5～60ng/mL人骨成型蛋白、5～60ng/mL血管内皮生长因子、5～60uMY
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27632；所述第二培养液包括：细胞基础培养基2、10～20vol％热灭活的人AB血清、1～10mML
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谷氨酰胺、0.1～2μMβ
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巯基乙醇、2～8ng/mL亚硒酸钠、10～50μM乙醇胺、10～40mg/L抗坏血酸、5～150ng/mL干细胞因子、5～100ng/mL白细胞介素7、5～100ng/mL白细胞介素15、1～50ng/mL酪氨酸激酶受体3配体；所述第三培养液包括：所述第二培养液和2～50ng/mL白细胞介素3。2.如权利要求1所述的将IPS细胞诱导为NK细胞的试剂盒，其特征在于，按体积比计算，所述细胞基础培养基1由以下组分组成：IMDM培养基：F12培养基＝1:1；所述第一培养液还包括2mM0.5vol％青霉素
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链霉素。3.如权利要求1所述的将IPS细胞诱导为NK细胞的试剂盒，其特征在于，按体积比计算，所述细胞基础培养基2由以下组分组成：DMEM培养基：F12培养基＝5～5.5：2.5～2.8；所述第二培养液还包括1vol％青霉素
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链霉素。4.如权利要求1所述的将IPS细胞诱...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾皓宇，沈振波，蒋碧愉，毛娟璇，陈诗仪，吴振涛，
申请(专利权)人：广东普罗凯融生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：