一种脐带来源骨骼干细胞的提取分离方法技术

本发明专利技术属于细胞生物学技术领域，公开了一种脐带来源骨骼干细胞的提取分离方法，所述分离方法包括以下步骤：(1)将脐带组织切成小块，静置25～40min，加入培养基，培养；(2)待脐带组织块边缘爬出细胞，剥离脐带组织块，收集爬出的细胞；(3)对步骤(2)收集的细胞进行分选，得到脐带来源的骨骼干细胞。本发明专利技术所提供的方法能从脐带中快速分离骨骼干细胞，获得骨骼干细胞的原代培养时间大大缩短，且爬出细胞多，分布均匀，生长速度快。生长速度快。

【技术实现步骤摘要】
一种脐带来源骨骼干细胞的提取分离方法


[0001]本专利技术属于细胞生物学
，具体涉及一种脐带来源骨骼干细胞的提取分离方法。

技术介绍

[0002]骨骼干细胞(skeletal stem cell，SSC)是近年来在软骨细胞中发现的一类干细胞亚型，在Nature，Cell等知名杂志相继进行了相关报道，此类干细胞具有定向分化为软骨和骨骼的能力。SSC在体外具有自我更新的能力，实验表明在小鼠肾下移植，能够线性地分化出含有骨、软骨和基质的多向性小骨(multilineage ossicles)：首先分化出早期骨、软骨和基质的祖细胞(human bone，cartilage and stromal progenitor，hBCSP)，接着是骨祖细胞(human osteoprogenitor，hOP)和软骨祖细胞(human chondroprogenitor，hCP)，最后才分化出骨骼、软骨和基质细胞。SSC不会分化为脂肪细胞，SSC具有以下特征：
①
分布于骨骼相关的间充质中，包括骨、软骨、脂肪及骨髓基质；
②
SSC谱系分化方向明确；
③
体内外均可自我更新和克隆形成；
④
体内外均能多向分化；
⑤
在体内移植实验中可保持异位成骨能力。
[0003]因此，SSC是一群间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)异质性更低、表面标志物更明确和克隆形成能力更强的干细胞。SSC存在于胎儿和成人骨骼中，也可以源自BMP2处理的人类脂肪基质(human adipose stroma，B
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HAS)和诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)中，可通过以PDPN
+
CD146
‑
CD73
+
D164
+
为特征分选得到。与小鼠SSC类似，人的以PDPN
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CD146
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CD73
+
CD164
+
为特征的SSC同样具有自我更新和克隆形成能力，Elisia D.Tichy等研究表明在肾移植实验中表现出持续的异位成骨能力，骨缺损时可迅速增殖分化。该细胞可生成骨骼、软骨和基质的祖细胞，但不生成脂肪。单个SSC的基因表达分析揭示了从不同来源获得的SSC之间具有总体相似性，但是略有不同，揭示了胎儿来源和iPSC衍生的人骨骼干细胞(human skeletal stem cell，hSSC)具有向软骨的倾斜分化的趋势。hSSC会因急性骨骼损伤而激活进行局部扩增。此外，hSSC衍生的基质可以在无血清培养条件下维持人类造血干细胞(human hematopoietic stem cells，hHSC)生长。Matthew P.Murphy等研究表明骨微骨折后，微环境中hSSC被激活可以诱导分化为软骨，可用于治疗局部性关节炎的软骨疾病。近年来，MSCs的旁分泌行为参与损伤组织修复、再生的功能成为生物制药研究的热点。众多研究人员通过体外培养实验证实了基于MSCs的旁分泌作用的条件培养基可以满足多种人源细胞体外培养的生长及扩增。
[0004]目前，已有大量研究结果表明，MSCs通过旁分泌作用分泌多种细胞因子，可以促进多种人源细胞的生长与增殖，为生物制药提供了一种更安全、有效的细胞培养途径。基于MSCs细胞外基质的培养基在现代生物制药领域有着广阔的发展前景。
[0005]BM
‑
MSCs是最早发现的一类间充质干细胞，Parekkadan等对BM
‑
MSCs条件培养基进行蛋白组学分析，检测到69种蛋白，其中大部分是细胞因子、生长因子和化学增活素，其中一些分子已经证明具有抗凋亡和刺激细胞增殖作用。
[0006]传统的分离骨骼干细胞SSC，多采用从骨髓、软骨及胎儿组织中获取组织后分选得到人骨骼干细胞，从上述组织中获得骨骼干细胞较为困难，且面临对供者伤害大，可获得细胞数量低，以及伦理问题。例如，临床中从骨髓中获得SSC，需要在手术中取得骨髓，目前临床能够取得骨髓的绝大多数为年纪70左右的骨科手术患者，此种来源由于患者年龄大，可获得相关细胞活力低，手术中可取骨髓量稀少，因此可获得SSC的数量和质量均难以满足临床研究或治疗应用需求。临床中从软骨中获得SSC更困难，人体软骨组织少，目前临床能够取得软骨的绝大多数为骨关节炎全关节置换手术获得软骨，患者自身病情显著影响对获得SSC的数量和质量，正常人软骨难以获得，且对供者造成二次伤害较大，获得SSC的数量和质量难以确定。从胎儿胚胎来源的SSC，面临来源少，伦理争议大的问题。

技术实现思路

[0007]针对现有技术手段难以获得大量活性高的SSC存在的难题，提供一种从脐带中提取分选得到骨骼干细胞的提取方法，通过设计一系列标准细胞分离提取流程，利用流式分选，能有效的获得大量骨骼干细胞，且细胞成活率较高，较其他组织分离SSC而言，更易于获得高质量的SSC。
[0008]本专利技术第一方面的目的，在于提供一种脐带来源的骨骼干细胞的分离方法。
[0009]本专利技术第二方面的目的，在于提供一种脐带来源的骨骼干细胞。
[0010]本专利技术第三方面的目的，在于提供本专利技术第一方面的分离方法或本专利技术第二方面的骨骼干细胞在制备修复组织损伤或组织再生的药物中的应用。
[0011]本专利技术第四方面的目的，在于提供一种骨骼干细胞制剂。
[0012]本专利技术第五方面的目的，在于提供本专利技术第一方面的分离方法或本专利技术第二方面的骨骼干细胞在制备促进成骨分化或软骨分化的药物中的应用。
[0013]为了实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案是：
[0014]本专利技术的第一个方面，提供一种脐带来源的骨骼干细胞的分离方法，包括以下步骤：
[0015](1)将脐带组织切成小块，静置25～40min，加入培养基，培养；
[0016](2)待脐带组织块边缘爬出细胞，剥离脐带组织块，收集爬出的细胞；
[0017](3)对步骤(2)收集的细胞进行分选，得到脐带来源的骨骼干细胞。
[0018]优选地，所述脐带组织选自人脐带组织、老鼠脐带组织、家兔脐带组织、狗脐带组织和猴脐带组织。
[0019]进一步优选地，所述脐带组织为人脐带组织。
[0020]优选地，所述培养基为含FBS的α
‑
MEM培养基。
[0021]进一步优选地，所述培养基为含8v/v％～15v/v％FBS的α
‑
MEM培养基。
[0022]更进一步优选地，所述培养基为含10v/v％～15v/v％FBS的α
‑
MEM培养基。
[0023]优选地，所述静置的时间为25～30min。
[0024]优选地，步骤(2)中待人脐带组织块周围爬出的细胞的外沿距脐带组织块边缘0.4～0.8cm时，剥离脐带组织本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种脐带来源的骨骼干细胞的分离方法，包括以下步骤：(1)脐带组织切成小块，静置25～40min，加入培养基，培养；(2)待脐带组织块边缘爬出细胞，剥离脐带组织块，收集爬出的细胞；(3)对步骤(2)收集的细胞进行分选，得到脐带来源的骨骼干细胞。2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述培养基为含FBS的α
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MEM培养基；所述培养基优选为含8v/v％～15v/v％FBS的α
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MEM培养基。3.根据权利要求2所述的分离方法，其特征在于，步骤(2)中待脐带组织块周围爬出的细胞的外沿距脐带组织块边缘0.4～0.8cm时，剥离脐带组织块。4.根据权利要求1～3中任一项所述的分离方法，其特征在于，所述分选包括通过荧光激活细胞分选、磁性细胞分选、荧光测定法、流式细胞术或显微技术进行分选。5.根据权利要求4所述的分离方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘衍志，高翔，
申请(专利权)人：深圳市奥思摩尔生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：