一种微小RNA、抑制剂和在自然杀伤细胞体外培养中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种微小RNA、抑制剂和在自然杀伤细胞体外培养中的应用。本发明专利技术发现，高良姜素‑3‑甲醚可以提高NK细胞的杀伤活性，可以提高NK细胞对肿瘤细胞的杀伤力，这可能与高良姜素‑3‑甲醚体外可以促进NK细胞分泌细胞毒颗粒有关，而miRNA‑191可能是高良姜素‑3‑甲醚发挥上述作用的一个靶标。

【技术实现步骤摘要】
一种微小RNA、抑制剂和在自然杀伤细胞体外培养中的应用
本专利技术属于免疫细胞领域，涉及免疫细胞培养，具体涉及一种微小RNA、抑制剂和在自然杀伤细胞体外培养中的应用。
技术介绍
NK细胞为固有免疫系统的重要组成部分，其与T、B细胞不同，T、B细胞的激活依赖于抗原致敏、抗体或主要组织相容性复合体的参与，而NK细胞不需要以上步骤的参与便能够直接杀伤靶细胞，因此，NK细胞对比于其他免疫细胞，可以更加快速有效地清除病变细胞，其免疫监视作用更为直接有效。NK细胞的上述功能使得其在肿瘤免疫细胞治疗领域得到广泛重视，也有越来越多的研究旨在使得NK细胞的上述功能进一步增强。MiRNA-191是一种微小RNA，研究发现其过表达对NK细胞的肿瘤杀伤活性有明显的抑制作用(MiR-191过表达抑制NK细胞的肿瘤杀伤活性和细胞凋亡，免疫学杂志，2020年)。据此推测，miR-191可能参与调节了NK细胞的肿瘤杀伤活性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种微小RNA、抑制剂和在自然杀伤细胞体外培养中的应用。本专利技术技术方案如下：一种微小RNA及其抑制剂用于NK细胞体外培养提高其杀伤活性的用途，所述微小RNA为miRNA-191。进一步地，所述抑制剂为高良姜素-3-甲醚。有益效果：本专利技术发现，高良姜素-3-甲醚可以提高NK细胞的杀伤活性，可以提高NK细胞对肿瘤细胞的杀伤力，这可能与高良姜素-3-甲醚体外可以促进NK细胞分泌细胞毒颗粒有关，而miRNA-191可能是高良姜素-3-甲醚发挥上述作用的一个靶标。附图说明图1中A为各组NK细胞的细胞毒颗粒的分泌水平；B为各组NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性；C为各组NK细胞中miRNA-191的表达水平。具体实施方式下面结合实施例具体介绍本专利技术实质性内容，但并不以此限定本专利技术的保护范围。一、实验材料人NK细胞购自深圳市豪地华拓生物科技有限公司，按照说明书提供的方法复苏、传代，取生长状态良好的人NK细胞用于实验。NK细胞培养液为德国CellGroSCGM，RPMI1640培养液和胎牛血清购GIBCO；高良姜素-3-甲醚(CAS：6665-74-3)购自成都普瑞法科技开发有限公司，纯度95％～99％。引物由广州锐博生物科技公司合成。二、实验方法1、NK细胞分泌细胞毒颗粒水平检测取生长状态良好的人NK细胞，用NK细胞培养液重悬制成细胞浓度为4×105/mL的细胞悬液，然后接种于12孔板中，每孔1mL，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养过夜(12h)。次日，各孔分别加入1mL含有不同浓度高良姜素-3-甲醚的NK细胞培养基，使得高良姜素-3-甲醚的终浓度分别为0μM(对照组)、2μM(低浓度组)、5μM(高浓度组)，每个浓度3个复孔。于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中继续培养48h，收集细胞，PBS洗涤、重悬，各取等量细胞分别加入PE-CD107a、穿孔素、颗粒酶B，采用流式细胞术检测PE-CD107a、穿孔素、颗粒酶B的表达水平。2、NK细胞对肿瘤细胞杀伤活性检测靶细胞的准备：对数生长期的K562细胞；效应细胞的准备：取生长状态良好的人NK细胞，用NK细胞培养液重悬制成细胞浓度为4×105/mL的细胞悬液，然后接种于12孔板中，每孔1mL，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养过夜(12h)；次日，各孔分别加入1mL含有不同浓度高良姜素-3-甲醚的NK细胞培养基，使得高良姜素-3-甲醚的终浓度分别为0μM(对照组)、2μM(低浓度组)、5μM(高浓度组)，每个浓度3个复孔；于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中继续培养48h，收集细胞，PBS洗涤，备用；取K562细胞，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液调整细胞密度4×105/mL，接种于96孔板中，每孔加100μL；取人NK细胞，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液调整细胞密度，接种于96孔板中，使效靶比分别为5:1、10:1，每孔加100μL，同时设单独效应细胞孔、单独靶细胞孔和空白孔，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养24h，加入CCK8试剂10μL，孵育4h后，于450nm处测定OD值，扣除空白孔本底OD值并按公式计算：杀伤活性(％)＝[1-(实验孔OD值－单独效应细胞组OD值)/单独靶细胞OD值]×100％。3、微小RNA表达水平检测取生长状态良好的人NK细胞，用NK细胞培养液重悬制成细胞浓度为4×105/mL的细胞悬液，然后接种于12孔板中，每孔1mL，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养过夜(12h)。次日，各孔分别加入1mL含有不同浓度高良姜素-3-甲醚的NK细胞培养基，使得高良姜素-3-甲醚的终浓度分别为0μM(对照组)、2μM(低浓度组)、5μM(高浓度组)，每个浓度3个复孔。于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中继续培养48h，收集细胞，PBS洗涤，Trizol试剂抽提NK细胞总RNA，应用M-MLV逆转录酶试剂盒将RNA转化为cDNA，然后进行PCR反应(引物如下)，将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后采用凝胶成像系统观察，以GAPDH为内参，比较各组NK细胞中miRNA-191表达情况。miRNA-191上游引物：5’-TGGAGACTGGTCTCACGGTCTTACA-3’miRNA-191下游引物：5’-CACTAAAGTCCAGCTGGGTATAGTG-3’GAPDH上游引物：5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTCT-3’GAPDH下游引物：5’-GGGAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’4、统计学方法采用SPSS20.0统计软件进行数据分析，计量数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，以P＜0.05为差异有统计学意义。三、实验结果1、NK细胞分泌细胞毒颗粒水平各组NK细胞的细胞毒颗粒的分泌水平如表1和图1中A所示，与对照组相比，低、高浓度药物组NK细胞的CD107a、穿孔素和颗粒酶B的分泌水平均显著升高，且可见明显的剂量效应。NK细胞受到刺激后，细胞膜表面可见大量的CD107a分子，CD107a的表达水平可代表NK细胞的杀伤功能，是细胞毒活性的敏感指标；穿孔素和颗粒酶B也是细胞毒活性的敏感指标，前者使靶细胞膜形成穿孔，为后者进入靶细胞诱导靶细胞凋亡提供通道。表1各组NK细胞的细胞毒颗粒的分泌水平2、NK细胞对肿瘤细胞杀伤活性各组NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性如表2和图1中B所示，与对照组相比，低、高浓度药物组NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性均显著升高，且可见明显的剂量效应。表2各组NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性3、微小RNA表达水平琼脂糖凝胶电泳成像结果如图1中C所示，与对照组相比，低、高浓度药物组NK细胞中miRNA-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种微小RNA及其抑制剂用于NK细胞体外培养提高其杀伤活性的用途，所述微小RNA为miRNA-191。/n

【技术特征摘要】
1.一种微小RNA及其抑制剂用于NK细胞体外培养提高其杀伤活性的用途，所述微小RNA为miRNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：张文化，
申请(专利权)人：张文化，
类型：发明
国别省市：安徽;34