体外扩增和活化自然杀伤细胞的方法及其药物组合物技术

本发明专利技术涉及一种体外扩增和活化自然杀伤细胞的方法，该方法以含有纳豆激酶的培养基进行自然杀伤细胞培养，专属针对自然杀伤细胞提供优化的培养环境，且在不使用癌饲养细胞共同培养的条件下，有效率地提升细胞扩增倍数，并产生高纯度及对癌细胞具有高度毒杀活性的自然杀伤细胞。本发明专利技术还涉及一种用于抑制肿瘤细胞增殖的药物组合物，其包含自然杀伤细胞。

【技术实现步骤摘要】
体外扩增和活化自然杀伤细胞的方法及其药物组合物
本专利技术涉及一种体外扩增和活化自然杀伤细胞的方法。本专利技术还涉及一种包含自然杀伤细胞的药物组合物。
技术介绍
自然杀伤细胞(NaturalKillerCells；NK细胞)是一群具备CD3-CD56+表现型的细胞，通常存在于淋巴结、各器官及外周血液中。NK细胞在人体外周血液淋巴细胞中约占5～20％，因此外周血液是NK细胞方便的来源之一。NK细胞在1970年代被发现具有毒杀癌细胞之特性，且事先不需要经过教育或致敏(Priming)的过程。之后研究发现，NK细胞除了可以毒杀癌细胞之外，还可以杀死病毒感染的细胞、癌化的细胞及老化应激的细胞(StressedCells)。过去的研究已显示NK细胞具有治疗肿瘤的潜力。自体NK细胞治疗癌症之做法，是将病人外周血液之NK细胞分离后，以体外细胞扩增和活化的技术培养约14天，再输注入该病人体内以达到治疗癌症之效果。过去实施体外细胞扩增和活化方法时，多数将NK细胞与癌饲养细胞(Cancerfeedercell)共同培养，以达到大幅提高NK细胞数量的目的。但使用癌饲养细胞之扩增方法仍无法解决安全性的问题。在将扩增后自然杀伤细胞输注病人体内前，难以确定癌饲养细胞是否已完全去除，因此产生安全性的疑虑。再者，即使体外培养后的NK细胞数量有大幅提升，若该NK细胞毒杀癌细胞的活性不佳，后续应用于自体细胞疗法之效果仍非常有限。据此，有必要开发一种不使用癌饲养细胞的NK细胞体外扩增方法，且该方法能有效率地提升NK细胞扩增倍数，并产生高纯度及高癌细胞毒杀活性的NK细胞。纳豆激酶(nattokinase)是纳豆枯草杆菌(Bacillussubtilisnatto)所分泌的胞外酶，已知具有溶解血栓的活性及分解纤维蛋白之功能，可应用于心血管疾病之预防及治疗。纳豆激酶目前以口服给予，以营养补充品的形式使用。尽管已有研究探讨个体食用纳豆或纳豆萃取物，有助于调节个体的免疫力(Takedaetal.,Traditional&KampoMedicine,Vol.3Iss.2100-106,2016)，但其作用的有效成分及相关机制目前仍不清楚。此外，纳豆激酶应用于体外免疫细胞培养方法与效用，目前未有相关研究。
技术实现思路
本专利技术一方面提供一种体外扩增和活化自然杀伤细胞的方法，其包含以下步骤：自血液样品分离出外周血单核细胞；自该外周血单核细胞分离出自然杀伤细胞；将该自然杀伤细胞悬浮于含有纳豆激酶的培养基并置于细胞培养盘中培养；以及每隔二至三天更换该含有纳豆激酶的培养基，培养12至16天。本专利技术另一方面，提供一种体外扩增和活化自然杀伤细胞的方法，该方法所使用的培养基含有浓度为5FU/ml至20FU/ml的纳豆激酶。本专利技术另一方面，提供一种体外扩增和活化自然杀伤细胞的方法，该方法所使用的培养基还包含辅酶Q10，其中该辅酶Q10在该培养基中的浓度为100nM至1000nM。在本专利技术一些具体实施方式中，以体外扩增和活化自然杀伤细胞方法所产生的细胞中21％至41％是NKG2A+CD3-CD56+细胞。在本专利技术一些具体实施方式中，以体外扩增和活化自然杀伤细胞方法所产生的细胞中41％至71％是TRAIL+CD3-CD56+细胞。在本专利技术一些具体实施方式中，该体外扩增和活化自然杀伤细胞方法不包含将自然杀伤细胞与癌饲养细胞共同培养的步骤。在本专利技术一些具体实施方式中，该体外扩增和活化自然杀伤细胞方法可达到1135倍至1750倍的细胞扩增倍数。本专利技术另一方面涉及一种细胞，其以前述的方法制得。在本专利技术一些具体实施方式中，以前述方式制得的细胞中，包含92％至97％的自然杀伤细胞。在本专利技术一些具体实施方式中，以前述方式制得的细胞，当该细胞与K562细胞在活体外以5:1的比率共同培养时，所述细胞具有63％至81％的癌细胞毒杀活性。本专利技术另一方面涉及一种用于抑制肿瘤细胞增殖的药物组合物，其包含以上述方法制得的自然杀伤细胞及药学上可接受的赋形剂。附图说明图1是本专利技术实施例1的NK细胞体外扩增和活化方法流程图；图2是本专利技术所产生的细胞扩增倍数分析；图3是本专利技术所产生的NK细胞毒杀癌细胞的能力测试结果，其中图3A以K562作为被NK细胞毒杀的癌细胞株，其中图3B以HepG2、HT-29以及A549作为被NK细胞毒杀的癌细胞株；图4是本专利技术所产生的NK细胞抑制癌细胞生长的小鼠实验结果。具体实施方式有鉴于上述待解决之问题，本专利技术提出一种不使用癌饲养细胞之NK细胞体外扩增方法，该方法将纳豆激酶应用于NK细胞体外扩增，提供NK细胞良好的培养环境，有效率地提升NK细胞扩增倍数，并产生高纯度及高癌细胞毒杀活性之NK细胞。定义用于本说明书，“自然杀伤细胞”(Naturalkillercell，简称NK细胞)指细胞表面抗原呈现CD3-CD56+的细胞。用于本说明书，“癌饲养细胞”(cancerfeedercell)指体外免疫细胞培养中，加入活的癌细胞共同培养以达到提升免疫细胞扩增的效果，加入的其他活的癌细胞称之为癌饲养细胞。用于本说明书，“细胞扩增倍数”以下列方式判断：“经体外培养14天后的细胞数量”除以“自外周血单核细胞分离出之起始NK细胞数量”。用于本说明书，“毒杀癌细胞的活性”是以K562细胞株或其他癌细胞株为靶标细胞(targetcell)，并以NK细胞为效应细胞(effectorcell)，在效应细胞与靶标细胞的比例(E:Tratio)为5:1的情况下，将靶标细胞死亡的比例做为毒杀效率。材料与方法本专利技术所述外周血样品，依据伦理委员会通过的计划，自受试者手臂采集全血，置于无菌采血管，于室温存放待后续处理。本专利技术所使用的基础培养基可选用自：CellGroSCGM(CellGenix公司)、KBM501(KohjinBio公司)、AIM-V(ThermoFisher公司)、X-VIV015(Lonza公司)、DMEM及RPM1-1640等市售培养基。本专利技术所述培养基中，有时含有适当的蛋白质、细胞激素、抗体、血清、化合物等成分。所述细胞激素有时为白介素-2(IL-2)、白介素-3(IL-3)、白介素-7(IL-7)、白介素-12(IL-12)、白介素-15(IL-15)、白介素-18(IL-18)或白介素-21(IL-21)。自PBMC分离NK细胞的方法包括但不限于使用Dynabeads(Invitrogen公司)、CliniMACS磁珠(MiltenyiBiotec公司)或其他市售的免疫磁珠，将表达细胞表面抗原CD3和/或CD34的细胞分离除去，达到纯化NK细胞之效果。以流式细胞仪方式分析细胞表面抗原以2x105细胞/50μl将扩增和活化后的细胞置于96孔盘，并加入3μl荧光标记的抗体于4℃反应15分钟，接着以磷酸盐缓冲生理食盐水(Phosphatebuffersa本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种体外扩增和活化自然杀伤细胞的方法，其包含以下步骤：/n(a)自血液样品分离出外周血单核细胞；/n(b)自所述外周血单核细胞分离出自然杀伤细胞；/n(c)将所述自然杀伤细胞悬浮于含有纳豆激酶的培养基并置于细胞培养盘中培养；以及/n(d)每隔二至三天更换所述含有纳豆激酶的培养基，培养12至16天；/n其中所述纳豆激酶在所述培养基中的浓度为5FU/ml至20FU/ml。/n

【技术特征摘要】
1.一种体外扩增和活化自然杀伤细胞的方法，其包含以下步骤：
(a)自血液样品分离出外周血单核细胞；
(b)自所述外周血单核细胞分离出自然杀伤细胞；
(c)将所述自然杀伤细胞悬浮于含有纳豆激酶的培养基并置于细胞培养盘中培养；以及
(d)每隔二至三天更换所述含有纳豆激酶的培养基，培养12至16天；
其中所述纳豆激酶在所述培养基中的浓度为5FU/ml至20FU/ml。


2.如权利要求1所述的方法，其中所述培养基还包含辅酶Q10；其中所述辅酶Q10在所述培养基中的浓度为100nM至1000nM。


3.如权利要求2所述的方法，其中所述培养基还包含基础培养基以及细胞激素。


4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述方法产生的细胞中21％至41％是NKG2A+CD3-CD56+细胞。


5.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述方法产生的细胞中41％至71％是TRAIL+CD3-CD56+细胞。


6.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：张顺浪，林杰良，杨智雅，
申请(专利权)人：基亚生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：中国台湾;71