本发明专利技术涉及免疫细胞靶向治疗技术领域，特别涉及一种优化的从人体外周血或外周血单个核细胞中分离纯化记忆性免疫细胞（TCM）或CD8T+细胞试剂盒，TCM诱导扩增试剂盒及产品质量控制鉴定的试剂盒体系和应用。在临床应用中，TCM细胞培养过程中采用的试剂较多，标准不一致，培养过程中工作量大，培养时间长，工艺繁琐，不稳定，染菌风险大，细胞质量标准难以控制，许多技术人员很难在短时间内培养出质量均一的TCM细胞，迫切需要开发简单、格式化的试剂盒，同时本发明专利技术通过进一步优化诱导因子组合物TCM‑III，节省了原材料，降低了生产成本；诱导培养前用TCM‑II包被培养板TCM细胞增殖倍数提高了2‑3倍，凋亡指数降低，活性提高了10%‑20%，有效细胞的绝对数量提高了2‑3倍；TCR基因转染前，用TCM‑II包被培养板可提高转染效率。本发明专利技术改进了工艺，这对临床上提高肿瘤治疗疗效，清除残留病灶，防止肿瘤的复发和转移具有重要的意义。
【技术实现步骤摘要】
一种优化的临床用TCM分选、诱导培养和质量控制鉴定试剂盒及应用
本专利技术涉及免疫细胞靶向治疗
，特别涉及一种优化的从人体外周血或外周血单个核细胞中分离纯化记忆性免疫细胞（TCM）或CD8T+细胞试剂盒，TCM诱导扩增试剂盒及产品质量控制鉴定的试剂盒体系和应用。
技术介绍
过继性细胞治疗技术为打破肿瘤患者中枢和外周免疫耐受，恢复或增强其抗肿瘤免疫功能提供了一种有效的方法。然而目前还存在不少问题亟待解决，包括：1)如何获得充分数量的肿瘤反应性T细胞是决定过继性细胞治疗效果的最关键因素；2)目前回输的免疫细胞尤其是克隆化CD8+T细胞在体内难以长期存活，极大的影响了过继性细胞治疗的临床疗效。记忆性T细胞在体内再次遭遇相同抗原时可迅速活化发挥免疫效应，同时具有自我更新能力，能够提供更为长期的免疫保护，可能为过继性细胞治疗提供更为合适的免疫效应细胞。有望在回输体内后建立更长期的抗肿瘤免疫。分离记忆性T细胞并通过TCR基因转染有望提供具有更强生存能力和效应功能的肿瘤反应性T细胞。本专利技术人2017年专利技术了《外周血单个核细胞诱导的记忆性免疫细胞及应用》（专利号：201710712565.6），在临床应用中，TCM细胞培养过程中采用的试剂较多，标准不一致，培养过程中工作量大，培养时间长，工艺繁琐，不稳定，染菌风险大，细胞质量标准难以控制，许多技术人员很难在短时间内培养出质量均一的TCM细胞，迫切需要开发简单、格式化的试剂盒，同时本专利技术通过进一步优化诱导因子组合物TCM-III，节省了原材料，降低了生产成本；诱导培养前用TCM-II包被培养板TCM细胞增殖倍数提高了2-3倍，凋亡指数降低，活性提高了10%-20%，有效细胞的绝对数量提高了2-3倍；TCR基因转染前，用TCM-II包被培养板可提高转染效率。本专利技术改进了工艺，这对临床上提高肿瘤治疗疗效，清除残留病灶，防止肿瘤的复发和转移具有重要的意义。
技术实现思路
为了解决过继性细胞治疗技术中免疫细胞在体内难以长期存活，缺少靶向性的问题；本申请提供了一种从人体外周血或低温冻存的外周血单个核细胞（PBMC）中分离纯化记忆性T细胞（TCM）或CD8T+细胞，TCM诱导活化率高的试剂盒及应用，然后将肿瘤特异或病毒特异性TCR基因转染自体TCM，使免疫细胞治疗具有长效性和靶向性。本专利技术是通过以下步骤得到的：1.TCM或CD8T+细胞的分选、刺激与基因转染（1）本专利技术提供一种人体外周血TCM或CD8T+细胞分选试剂盒以及产品鉴定试剂盒。(2)所述人体TCM或CD8T+细胞分选试剂盒包括，CD8重力柱，Reagent1：CD8纯化试剂，由CD8Fab-Strep和BufferCI构成。Reagent2：CD62L+纯化试剂，由CD62L+Fab-Strep和BufferIS构成。Reagent3：CD45RA-纯化试剂，由CD45RA-Fab-Strep和BufferIS构成。Reagent4：Strep-TactinMagneticMicrobeads.Reagent5：洗脱液，由D-biotin和BufferIS构成。（3）所述TCM或CD8T+细胞分选试剂盒的使用方法1）用8mlBufferCI冲洗CD8重力柱。2）加1mlReagent1到步骤1中的重力柱中。3）加2mlBufferCI冲洗步骤2上样后的重力柱。4）PBMC按照密度1x106-1x107/ml上柱或者外周血按照体积66ml上柱。5）用40mlBufferCI冲洗柱子四次，每次10ml。6）用Reagent5洗脱细胞，400g离心6-10min收集细胞，得到CD8+T细胞。7）去掉上清，用合适的BufferIS重悬，进行下一步的分选。8）取50-100ulReagent2和150-300ulReagent4混合后，摇床摇30min。9）取1-2x108PBMC用900-1500ulBufferIS重选，加到上述步骤8中。摇床中摇20min。10）加5mlBufferIS到步骤9中，放磁极上，水平放置，静止3min后，去掉上清液，再用5mlBufferIS重选。11）重复步骤10。12）Reagent5重悬阳性标记的细胞。室温静止10min，放置磁极上静止3min，将含有阳性细胞的上清液转移到新的反应管中。13）用5mlReagent5再洗一次，重复步骤12。14）混合两次的上清液，400g离心6-10min。15）去上清，用5mlBufferIS重悬细胞，摇床上摇10min。16）放置在磁极上静止3min。17）将上清转移到一个新的离心管中，400g离心6-10min。18）重复步骤8和9，400g离心6-10min收集细胞。19）去掉上清，用合适的BufferIS重悬，进行下一步的分选。通过连续两次阳性选择和CD45RA-阴选的方法，获得CD8+CD62L+CD45RO+细胞，对其进行内毒素检测和表型鉴定。（4）本专利技术提供一种CD8+T细胞分选试剂盒或TCM诱导培养试剂盒，包括容器和装入容器中的临床用TCM细胞无血清扩增完全培养液TCM-I和TCM细胞扩增包被液TCM-II和诱导因子组合物TCM-III：（5）本专利技术提供一种临床用无血清TCM细胞扩增完全培养液TCM-I，含有人体细胞生长必须的碳水化合物、促生长因子和激素、维生素、人血白蛋白、氨基酸、无机盐离子、微量元素、水、人白介素2和人白介素15。本专利技术不排除可以采用上述无血清完全培养基之外的培养基实施培养。（6）本专利技术提供一种TCM细胞扩增包被液TCM-II，它含有重组人纤维蛋白片段和PBS，重组人纤维蛋白片段的工作浓度为12.5ug/ml-50ug/ml。（7）本专利技术提供一种TCM细胞诱导因子组合物TCM-III，无血清TCM细胞扩增完全培养液TCM-I中添加300-1000u/mL人干扰素γ、50-200ng/mLCD3单抗、50-200ng/mLCD28单抗、50-200u/mL人白介素1α、30IU/mL人白介素7、30IU/mL人白介素15、500-2000u/mLIL-2。优选步骤（7）中TCM按照细胞密度1×106/mL用TCM-III重悬，其中添加500u/mLIFN-γ、120u/mLIL-1α、1000u/mLIL-2、30IU/mLIL-7、30IU/mL人白介素15、80ng/mLCD3单抗、80ng/mLCD28。第二天以后用TCM-I培养液对TCM或CD8T+细胞进行诱导扩增培养，经过12-14天的扩增培养，收获达到临床应用标准的TCM细胞，并对细胞制剂进行内毒素、活性和表型检测，细胞鉴定结果表明，细胞活性达到95%以上，同时含有较高比例的CD8-PE/CD62L+FITC/CD45RO-ECD、CD62L+FITC/CD45RO-ECD/CD44PE细胞；（8）质量检测合格的TCM细胞装入50-100ml生理盐水中，制成免疫细胞制剂，配合肿瘤临床治疗需要静脉回输。（9）本专利技术提及的无血清培养基和诱导因子或者TCM细胞分离液的原料可以从市场上购买，并且长期冷冻保存细胞和小分子蛋白的技术已经非常成熟，本领域技术人员完全可以利用上述技术保存组成本专利技术试剂盒的培养基和组合物。（10）本专利技术还包括将上述TCM或CD8T+本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种临床用TCM分选试剂盒或CD8T+细胞分选试剂盒、TCM诱导活化及产品量控制鉴定的试剂盒体系，其特征在于，包含人体外周血TCM分选或CD8T+细胞分选试剂盒、TCM诱导培养试剂盒和产品鉴定试剂盒，从外周血单个核细胞分选的免疫细胞，其特征在于将新鲜分离的全血或者经过冻存后复苏的外周血单个核细胞通过CD8T+细胞分选试剂盒或TCM分选试剂盒获得CD8+T细胞或CD8+CD62L+CD45RO+细胞：（1）人体TCM分选试剂盒或CD8T+细胞分选试剂盒包括：CD8重力柱，Reagent1：CD8纯化试剂，由CD8Fab‑Strep和Buffer CI构成；Reagent2：CD62L+纯化试剂，由CD62L+Fab‑Strep和Buffer IS构成； Reagent3：CD45RA‑纯化试剂，由CD45RA‑Fab‑Strep和Buffer IS构成；Reagent4：Strep‑Tactin Magnetic Microbeads.Reagent5：洗脱液，由D‑biotin和Buffer IS构成，试剂耗材在符合GMP标准条件下包装于容器中；（2）TCM诱导培养试剂盒，包括容器和装入容器中的临床用TCM细胞无血清扩增完全培养液TCM‑I和TCM细胞扩增包被液TCM‑II和诱导因子组合物TCM‑III：临床用无血清TCM细胞扩增完全培养液TCM‑I，含有人体细胞生长必须的碳水化合物、促生长因子和激素、维生素、人血白蛋白、氨基酸、无机盐离子、微量元素、水、人白介素‑2和人白介素15，本专利技术不排除可以采用上述无血清完全培养基之外的培养基实施培养；TCM细胞扩增包被液TCM‑II，它含有重组人纤维蛋白片段和PBS，重组人纤维蛋白片段的工作浓度为12.5ug/ml‑50ug/ml；TCM细胞诱导因子组合物TCM‑III，无血清TCM细胞扩增完全培养液TCM‑I中添加300‑2000u/mL 人干扰素γ、50‑200ng/mLCD3单抗、50‑200ng/mLCD28单抗、50‑200u/mL人白介素1α、30IU/mL白介素7、30IU/mL人白介素15、500‑2000u/mL IL‑2； 优选步骤TCM按照细胞密度1×106/mL用TCM‑III重悬，其中添加500u/mL IFN‑γ、120u/mL IL‑1α、1000u/mL IL‑2、30IU/mL IL‑7、30IU/mL人白介素15、80ng/mL CD3单抗、80ng/mL CD28，第二天以后用 TCM‑I培养液对TCM细胞进行扩增培养，经过12‑14天的扩增培养，收获达到临床应用标准的TCM细胞，并对细胞制剂进行内毒素、活性和表型检测，细胞鉴定结果表明，细胞活性达到95%以上，同时含有较高比例的CD8‑PE/CD62L+FITC/CD45RO‑ECD、CD62L+FITC/CD45RO‑ECD/CD44PE细胞；（3）TCM分选和诱导后鉴定试剂盒，所述临床用TCM细胞流式表型和活性鉴定试剂盒包括五组双色抗体组合物，分别是IgG‑FITC/IgG‑PE/IgG‑ECD、CD3‑FITC/CD8‑PE、CD8‑PE/CD62L+FITC/CD45RO‑ECD、CD62L+FITC/CD45RO‑ECD/CD44PE和Annexin‑FINKTC/PI，洗涤液50ml一管，固定液50ml一管；所述抗体每两种按照体积1:1混合装于1支棕色EP管中，每3‑8ul可检测一次，共计10‑50套，所述洗涤液是磷酸盐缓冲液；所述固定液是1%多聚甲醛；（4）本专利技术还包括将上述TCM分选试剂盒、无血清TCM细胞扩增完全培养液TCM‑I和TCM细胞扩增包被液体TCM‑II和TCM‑III装入专用洁净容器制备成试剂盒。...
【技术特征摘要】
1.一种临床用TCM分选试剂盒或CD8T+细胞分选试剂盒、TCM诱导活化及产品量控制鉴定的试剂盒体系，其特征在于，包含人体外周血TCM分选或CD8T+细胞分选试剂盒、TCM诱导培养试剂盒和产品鉴定试剂盒，从外周血单个核细胞分选的免疫细胞，其特征在于将新鲜分离的全血或者经过冻存后复苏的外周血单个核细胞通过CD8T+细胞分选试剂盒或TCM分选试剂盒获得CD8+T细胞或CD8+CD62L+CD45RO+细胞：（1）人体TCM分选试剂盒或CD8T+细胞分选试剂盒包括：CD8重力柱，Reagent1：CD8纯化试剂，由CD8Fab-Strep和BufferCI构成；Reagent2：CD62L+纯化试剂，由CD62L+Fab-Strep和BufferIS构成；Reagent3：CD45RA-纯化试剂，由CD45RA-Fab-Strep和BufferIS构成；Reagent4：Strep-TactinMagneticMicrobeads.Reagent5：洗脱液，由D-biotin和BufferIS构成，试剂耗材在符合GMP标准条件下包装于容器中；（2）TCM诱导培养试剂盒，包括容器和装入容器中的临床用TCM细胞无血清扩增完全培养液TCM-I和TCM细胞扩增包被液TCM-II和诱导因子组合物TCM-III：临床用无血清TCM细胞扩增完全培养液TCM-I，含有人体细胞生长必须的碳水化合物、促生长因子和激素、维生素、人血白蛋白、氨基酸、无机盐离子、微量元素、水、人白介素-2和人白介素15，本发明不排除可以采用上述无血清完全培养基之外的培养基实施培养；TCM细胞扩增包被液TCM-II，它含有重组人纤维蛋白片段和PBS，重组人纤维蛋白片段的工作浓度为12.5ug/ml-50ug/ml；TCM细胞诱导因子组合物TCM-III，无血清TCM细胞扩增完全培养液TCM-I中添加300-2000u/mL人干扰素γ、50-200ng/mLCD3单抗、50-200ng/mLCD28单抗、50-200u/mL人白介素1α、30IU/mL白介素7、30IU/mL人白介素15、500-2000u/mLIL-2；优选步骤TCM按照细胞密度1×106/mL用TCM-III重悬，其中添加500u/mLIFN-γ、120u/mLIL-1α、1000u/mLIL-2、30IU/mLIL-7、30IU/mL人白介素15、80ng/mLCD3单抗、80ng/mLCD28，第二天以后用TCM-I培养液对TCM细胞进行扩增培养，经过12-14天的扩增培养，收获达到临床应用标准的TCM细胞，并对细胞制剂进行内毒素、活性和表型检测，细胞鉴定结果表明，细胞活性达到95%以上，同时含有较高比例的CD8-PE/CD62L+FITC/CD45RO-ECD、CD62L+FITC/CD45RO-ECD/CD44PE细胞；（3）TCM分选和诱导后鉴定试剂盒，所述临床用TCM细胞流式表型和活性鉴定试剂盒包括五组双色抗体组合物，分别是IgG-FITC/IgG-PE/IgG-ECD、CD3-FITC/CD8-PE、CD8-PE/CD62L+FITC/CD45RO-ECD、CD62L+FITC/CD45RO-ECD/CD44PE和Annexin-FINKTC/PI，洗涤液50ml一管，固定液50ml一管；所述抗体每两种按照体积1:1混合装于1支棕色EP管中，每3-8ul可检测一次，共计10-50套，所述洗涤液是磷酸盐缓冲液；所述固定液是1%多聚甲醛；（4）本发明还包括将上述TCM分选试剂盒、无血清TCM细胞扩增完全培养液TCM-I和TCM细胞扩增包被液体TCM-II和TCM-III装入专用洁净容器制备成试剂盒。2.应用权利要求1所述的试剂盒体系制备TCM的方法，其特征在于，包括以下步骤：外周血CD8+T细胞或TCM分选：采集患者外周血80-200ml或者复苏冻存PBMC细胞，按照TCM分选试剂盒的使用方法进行分选，具体步骤如下：1）用8mlBufferCI冲洗CD8重力柱；2）加1mlReagent1到步骤1中的重力柱中；3）加2mlBufferCI冲洗步骤2上样后的重力柱；4）PBMC按照密度1x106-1x107/ml上柱或者外周血按照体积66ml上柱；5）用40mlBufferCI冲洗柱子四次，每次10ml；6）用Reagent5洗脱细胞，400g离心6-10min收集细胞，得到CD8+T细胞；7）去掉上清，用合适的BufferIS重悬，进行下一步的分选；8）取50-100ulReagent2和150-300ulReagent4混合后，摇床摇30min；9）取1-2x108PBMC用900-1500ulBuf...
【专利技术属性】
技术研发人员：路春光，
申请(专利权)人：路春光，
类型：发明
国别省市：吉林,22
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