一种极化和扩增CD4+T细胞的方法及组合物及在治愈表达特异性抗原的肿瘤中的应用技术

本发明专利技术属于生物细胞领域，涉及一种极化和扩增CD4+T细胞的方法及应用，本发明专利技术采取人源或鼠源的CD4+未分化T细胞，采用T细胞激活和转化生长因子β,白细胞介素‑4,白细胞介素‑21和γ‑干扰素中和抗体一系列细胞因子共同刺激。以此方法极化的T细胞，在大量增殖的情况下，如14日内500‑1000倍，同时保有针对癌细胞的杀伤性和自我分化增殖能力。其性状不同于之前报导过，用于对抗癌症的Th1,Th17和Th9等亚群，并且在杀伤癌症功效上有所超过。以这种方法极化的CD4+T细胞亚群,其对多种表达特异性抗原的癌症，包括固体和血液肿瘤有强大治疗作用。

A Polarization and Expansion Method and Composition of CD4+T Cells and Its Application in Curing Tumors Expressing Specific Antigens

The invention belongs to the field of biological cells, and relates to a method for polarizing and amplifying CD4+T cells and its application. The invention adopts human or mouse CD4+undifferentiated T cells, and uses T cells to activate and transform growth factor beta, interleukin 4, interleukin 21 and interferon gamma neutralizing antibody to stimulate a series of cytokines together. T cells polarized by this method can proliferate in large quantities, such as 500 to 1000 times within 14 days, while maintaining the killing and self-differentiation ability against cancer cells. It is different from Th1, Th17 and Th9, which have been reported before, and is more effective in killing cancer than Th1, Th17 and Th9. CD4 + T cell subsets polarized in this way have a powerful therapeutic effect on a variety of cancers expressing specific antigens, including solid and blood tumors.

【技术实现步骤摘要】
一种极化和扩增CD4+T细胞的方法及组合物及在治愈表达特异性抗原的肿瘤中的应用
本专利技术属于生物细胞领域，尤其涉及一种极化和扩增CD4+T细胞的方法及组合物及在治愈表达特异性抗原的肿瘤中的应用。
技术介绍
免疫细胞回输是近年专利技术的癌症治疗方法，其基本原理是：回输的细胞会对宿主的癌症细胞和癌症组织产生特异性的攻击性，或刺激宿主体内的其他免疫细胞，使其攻击癌症。研究者采用过多种细胞进行回输，包括T淋巴细胞，巨噬细胞(Macrophage)，自然杀伤细胞(NK)和自然杀伤T细胞(NKT)等。同时，很多实验采用了：以上列举细胞的加工和修饰(如嵌合抗原受体T细胞疗法，CAR-T)，或多种细胞联合使用，或采用细胞和其他药品/细胞素/疫苗的组合(比如注入T细胞后，持续注入IL-2)。T淋巴细胞的作用是主导的和不可或缺的，其他几种细胞独自使用几乎没有治疗效果。T细胞回输疗法，对血液肿瘤和固体肿瘤都产生了不同程度的治疗效果。CAR-T疗法，在治疗B细胞急性淋巴细胞白血病(BcellALL)上，取得了突破性的疗效。Novartis和KitePharma的治疗方案Kymriah和Yescarta，前者在BcellALL的化疗失败的病人身上取得了83％的癌症缓解率，后者在BcellALL和B细胞淋巴癌(DLBCL)化疗失败病人上，有51％的缓解率。但是这些疗法的缺陷之一是复发率较高。而且一旦复发，就不再有有效治疗手段。相对其它效果来说，T细胞回输疗法，对固体瘤疗效欠佳。科学家和医生尝试采过用癌症侵入T细胞，DC激活的外周血T细胞和CAR-T细胞等，对化疗失败的黑色素瘤，肠癌，食道癌，肺癌，脑胶质瘤等多种固体肿瘤治疗，但是至今极少有临床实验，反应率超过50％。多数实验的反应率仅在10％-20％。T细胞疗法疗法的功效和至少三个指标相关，一是T细胞对癌症的杀伤性，二是T细胞针对癌症的导向性，三是T细胞自身的存活。而且疗法如需成功，必须要专一性强，副作用小。其中导向性，使用CAR-T和癌症侵入T细胞则可以解决。T细胞的杀伤性和存活性，是目前急需增强的性质。如目前大多数实验室采用的细胞毒性CD8T细胞，在回输病人体内后，一个月内就会损失穿过99％。再如，数次CAR-T的临床试验中，有病人死于副作用-细胞素风暴。T细胞有很多亚群，比较为人熟知的有CD4+T细胞，CD8+T细胞和NKT细胞等等。其中每种又有更加细化的亚群划分，如CD4+T细胞，被研究者明确报导过的亚群分为Th1(HelperTCellType1)，Th2，Th9，Th17，Tfh(FollicleBhelperTcell)和Treg(RegulatoryTcell)。目前，大部分研究者在临床实验T细胞回输技术时，只关注采用了CD4+或CD8+的使用，而忽略了更加细分的亚群。如多数临床实验，采用的是纯化的CD8+T细胞，一小部分实验，采用了CD8+T细胞和CD4+T细胞按照1：1比例注射。另一小部分实验，采用了全CD4+T细胞。但是几乎没有临床实验深入关注CD8+和/或CD4+T细胞的具体构成。
技术实现思路
为了解决以上技术问题，本专利技术提供一种极化和扩增CD4+T细胞的方法及组合物及在治愈表达特异性抗原的肿瘤中的应用，能够诱导出一种新型T细胞亚群；诱导方法简单，易操作，产生的亚群在基因表达和性状上，也明显区别于现有的T细胞，诱导出的新型T淋巴细胞对呈递特异性抗原的固体和血液肿瘤有强大的杀伤力和清除性，同时拥有长期存活，抵抗疲劳，不会分化为调控性T细胞，不会引起细胞因子风暴(副作用低)和癌症组织导向性等。这种新型T细胞亚群具有干细胞和强力的体内生存能力。本专利技术提供解决以上技术问题的一种极化和扩增CD4+T细胞的方法：包括以下步骤：(1)获取纯化的CD4+T细胞：分离纯化或诱导培育后的CD4+T细胞、CD4+或CD62L+T细胞；(2)激活细胞：在特殊培养基中0-24小时内激活步骤(1)中获得的细胞；激活方法为Dynabeads,antiCD3抗体加antiCD28抗体，通过DC细胞呈递特异性多肽,ConcanavalinA试剂或BrefeldinACocktail(phorbol12-myristate-13-acetate,ionomycin,加BrefeldinA)试剂或类似试剂。(3)培养及细胞增殖：在激活后的第三天，将细胞离心，去上清，并培养于辅以10％胎牛血清，抗生素(Antibiotic-Antimycotic(1X)-ThermoFisherScientific)和100U/mL白细胞介素-2的RPMI-1640(后简称为RPMI)培养基中；刺激增值和诱导分化；被激活后的T细胞会呈现快速的增殖，细胞数加倍时间小于24小时。整体扩增时间大约会持续14天。细胞加倍时间，是衡量细胞增值速度的一个标准。时间越短，细胞增殖越快。本专利技术中细胞每天以2-10倍的速度增殖，增殖持续≥14天。保护极化增殖刺激至少7天，至多14天后的细胞特性。(4)取激活末期的细胞并检测，即可。处于激活末期的T细胞即为成品，应对其功效进行检测，包括体外实验和体内实验。所述步骤(1)中的细胞来源包括并不限于人源的外周血，脐带血，免疫器官内的血细胞和血前体细胞，癌症侵入淋巴细胞(包括原位肿瘤和转移肿瘤)和鼠源的外周血和免疫器官内的血细胞，比如从脾脏或淋巴结获取。初始的CD4+T细胞包括所有表达CD4表面抗原的T细胞。包括但不限于，人外周血，脐带血，癌症侵入细胞，以及其他事先操作过的CD4+T细胞。可先从骨髓，脐带血等来源取得造血干细胞，淋巴母细胞等T细胞前体，并诱导分化至CD4+T细胞。所述步骤(2)中激活细胞的培养基为RPMI辅以10％胎牛血清的培养基中加入100ng/ml转化生长因子β,100ng/mL白细胞介素-4,100ng/mL白细胞介素-21、100ng/mL的γ-干扰素中和抗体,或相同试剂，不同浓度；所述步骤(3)中培养基为RPMI辅以10％胎牛血清+抗生素和100u/ml白细胞介素-2。这样诱导过的细胞，输回病人体内，对癌症有杀伤力。所述步骤(2)中采用免疫磁珠(Dynabeads)激活T细胞，免疫磁珠和细胞比例为1:1，或相似比例。所述步骤(3)前还有对CD4+T细胞进行修饰步骤；如对T细胞转导嵌合抗原受体或其他细胞因子。优化方案中所述修饰步骤可以在CD4+T细胞被激活后4小时-96小时完成；更进一步优化方案中所述修饰步骤在CD4+T细胞被激活后24小时内完成。所述修饰步骤为对CD4+T细胞转染或转导一段由DNA或RNA为载体的编码基因；优化方案中所述转染或转导的编码基因，包扩但不限于嵌合式抗原受体，T细胞受体序列或其他细胞素或细胞表面受体；所述转染或转导的方法包括但不限于使用逆转录病毒，慢病毒或转座子。所述转染或转导的方法依次包括按照序列生产DNA质粒步骤、采用这些质粒进行逆转录病毒的包裹步骤、取得宿主T细胞并进行激活和极化步骤、在极化24小时后采用病毒对T细胞进行转导步骤，以及用上述方法继续扩增T细胞，直到达到所需的T细胞数目，或T细胞停止扩增。应用时可将细胞通过静脉回输进宿主体内；选择同时辅助以其他癌症疗法，包括但不限于细胞因子注射；即选择细胞素注射作为疗法的一部份，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种极化和扩增CD4+T细胞的方法：包括以下步骤：获取纯化的CD4+T细胞：分离纯化或诱导培育后的CD4+T细胞、CD4+或CD62L+ T细胞；（2）激活细胞：在培养基中0‑24小时内激活步骤（1）中获得的细胞；（3）培养及细胞增殖：在激活后的第三天，将细胞离心，去上清，并培养于辅以10%胎牛血清，抗生素和100U/mL 白细胞介素‑2的培养基中；刺激增值和诱导分化；（4）取激活末期的细胞并检测，即可。

【技术特征摘要】
1.一种极化和扩增CD4+T细胞的方法：包括以下步骤：获取纯化的CD4+T细胞：分离纯化或诱导培育后的CD4+T细胞、CD4+或CD62L+T细胞；（2）激活细胞：在培养基中0-24小时内激活步骤（1）中获得的细胞；（3）培养及细胞增殖：在激活后的第三天，将细胞离心，去上清，并培养于辅以10%胎牛血清，抗生素和100U/mL白细胞介素-2的培养基中；刺激增值和诱导分化；（4）取激活末期的细胞并检测，即可。2.根据权利要求1所述的一种极化和扩增CD4+T细胞的方法，其特征在于：所述步骤（1）中的细胞来源包括并不限于人源的外周血，脐带血，免疫器官内的血细胞和血前体细胞，癌症侵入淋巴细胞和鼠源的外周血和免疫器官内的血细胞。3.根据权利要求1所述的一种极化和扩增CD4+T细胞的方法，其特征在于：所述步骤（2）中激活细胞的培养基为RPMI-1640辅以10%胎牛血清的培养基中加入100ng/ml转化生长因子β,100ng/mL白细胞介素-4,100ng/mL白细胞介素-21、100ng/mL的γ-干扰素中和抗体,或相同试剂，不同浓度；所述步骤（3）中培养基为RPMI-1640辅以10%胎牛血清+抗生素和100u/ml白细胞介素-2。4.根据权利要求1所述的一种极化和扩增CD4+T细胞的方法，其特征在于：所述步骤（2）中采用免疫磁珠激活T细胞，免疫磁珠和细胞比例为1:1，或相似比例。5.根据权利要求1所述的一种极化和扩增CD4+T细胞的方法，其特征在于：所述步骤（3）前还有对CD4+T细胞进行修饰步骤；优化方案中所述修饰步骤可以在CD4+T细胞被激活后4-96小时完成；更进一步优化方案中所述修饰步骤在CD4+T细胞被激活后24小时内完成。6.根据权利要求5所述的一种极化和扩增CD4+T细胞的方法，其特征在于：所述修饰步骤为对CD4+T细胞转染或转导一段由...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲁勇，田野，孙涛，
申请(专利权)人：鲁勇，田野，孙涛，
类型：发明
国别省市：上海,31