一种RFF2细胞的构建方法技术

本发明专利技术公开提供了一种RFF2细胞的构建方法，属于生物技术领域。本发明专利技术公开用于构建一种攻防兼顾、具有特异性杀伤作用的特异性T细胞，即一种用于细胞免疫治疗的RFF2细胞，精准性好、杀伤率高。所述构建方法包括以下步骤：PBMC细胞负载致肿瘤突变的多肽，而后对负载多肽后的PBMC细胞进行多肽冲击；冲击后扩大培养，以得到FF细胞；以致肿瘤突变的多肽作为抗原直接刺激该FF细胞以筛选精准多肽；以精准多肽负载PBMC细胞，而后培养，并在培养过程中，用精准多肽进行多次冲击；冲击后继续培养，得到RFF细胞；用PD1等抗体对所得RFF细胞进行免疫抑制性信号分子体外封闭，以得到RFF2细胞。所述构建方法可用于细胞免疫治疗技术。

A Method of Constructing RFF2 Cells

The invention discloses a method for constructing RFF2 cells, which belongs to the field of biotechnology. The invention discloses a specific T cell with both attack and defense and specific killing effect, namely RFF2 cell for cell immunotherapy, which has good precision and high killing rate. The construction method includes the following steps: PBMC cells are loaded with mutagenic polypeptides, and then impacted with polypeptides; after impacting, PBMC cells are expanded to obtain FF cells; as a result, the mutant polypeptides of tumors are directly stimulated as antigens to screen precise polypeptides; PBMC cells are loaded with precise polypeptides, and then cultured, and in the course of culture, precise polypeptides are used to screen precise polypeptides. RFF cells were cultured after shock, and immunosuppressive signal molecules were blocked by antibodies such as PD1 in vitro to obtain RFF 2 cells. The construction method can be used in cell immunotherapy technology.

【技术实现步骤摘要】
一种RFF2细胞的构建方法
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种RFF2细胞的构建方法。
技术介绍
肿瘤细胞免疫治疗是一种新兴的肿瘤治疗模式，它从病人体内采集免疫细胞，然后进行体外培养和扩增，再回输到病人体内，来激发以及增强机体的自身免疫功能以治疗肿瘤。肿瘤细胞免疫治疗是继手术、放疗和化疗之后的第四种肿瘤治疗方法。正常或生物工程改造过的人体细胞移植或输入患者体内，新输入的细胞可以替代受损细胞、或者具有更强的免疫杀伤功能，从而达到治疗疾病的目的。生物工程改造过的细胞用特殊方法在体外培养过程中加以改造，可提高其杀伤性，有效杀除患者体内肿瘤细胞。如，中国专利申请CN201210194280.5提供了一种人细胞因子诱导的杀伤细胞。中国专利申请CN201510034781.0提供一种肿瘤细胞特异性多克隆T细胞。中国专利申请CN201510013987.5提供一种抗肿瘤T细胞及其制备方法。中国专利申请CN201711060030.1提供一种治疗艾滋病合并淋巴瘤的CAR-T细胞及其制备方法和应用。中国专利申请CN201610824893.0提供一种抗体调控的双抗原特异性T细胞及其制备方法和应用。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种RFF2细胞的构建方法，以便构建一种新的用于细胞免疫治疗的特异性T细胞(命名为RFF2细胞)。通过联合多肽冲击和细胞体外扩增、体外封闭，提供一种具有特异性杀伤作用、攻防一体的T细胞，解决了免疫细胞在细胞免疫治疗中攻防不能兼顾的问题，精准性好、杀伤率高。本专利技术提供一种RFF2细胞的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：S1)PBMC细胞负载致肿瘤突变的多肽，而后对负载多肽后的PBMC细胞进行一次多肽冲击；S2)冲击后扩大培养，以得到FF细胞；S3)以致肿瘤突变的多肽作为抗原直接刺激所述FF细胞以筛选精准多肽；S4)以步骤S3筛选的精准多肽负载PBMC细胞，而后培养，并在培养过程中，以精准多肽进行多次冲击；S5)冲击后继续培养，得到RFF细胞；S6)用单抗药对步骤S5所得RFF细胞进行免疫抑制性信号分子封闭，以得到RFF2细胞，所述免疫抑制性信号分子包括：PD-1、Tim-3、LAG3、CTLA-4、BTLA、VISTA、CD160、TIGIT、2B4(CD244)。进一步地，在步骤S2中，所述冲击后扩大培养，得到FF细胞包括：将多肽冲击后的PBMC细胞在预铺细胞刺激因子OKM-25的细胞培养装置中培养；培养一段时间后，转移至含有培养液OKM-100+12％FBS的细胞培养装置中继续培养；培养一段时间后，再转移至含有培养液OKM-200+5％FBS的细胞培养装置中继续培养。进一步地，步骤S4中，重复多肽冲击3～4次。进一步地，多肽冲击中，用浓度为10μg/mL～100μg/mL的多肽溶液进行多肽冲击。进一步地，步骤S4中，将负载精准多肽后的PBMC细胞在预铺细胞刺激因子OKM-25的细胞培养装置中培养，培养一段时间后用所得精准多肽进行多肽冲击，冲击时间1～4h；转移至含有培养液OKM-100+12％FBS的细胞培养装置(培养板或培养瓶)中继续培养，每隔3～4天再次用所确定的精准多肽进行多肽冲击，冲击时间1～4h。进一步地，所述致肿瘤突变的多肽由以下方法合成得到：1)外显子测序对肿瘤细胞进行全外显子测序；将全外显子测序结果与正常细胞的基因组相比，筛选出突变的氨基酸位点；2)抗原表位预测以突变的氨基酸位点为中心，向两侧延伸10个氨基酸，得到一段21个氨基酸的多肽，以此作为潜在抗原表位；IC50＜1000nM则认为此潜在抗原表位为抗原表位；3)合成多肽采用多肽固相合成法合成抗原表位肽。进一步地，所述肿瘤细胞来源于工程细胞系，包括H1299、H226、H358、H1563、H2228、A549、Renca、LLC小鼠Lewis肺癌细胞、CRL-6323B16F1、CRL-25394T1、U14小鼠子宫颈癌细胞、BV-2小鼠小胶质瘤细胞、G422小鼠神经胶质瘤细胞。进一步地，步骤S6中，将步骤S5所得RFF细胞以OKM-200+5％FBS进行重悬，而后加入终浓度为50～200μg/mL的单抗药，对RFF细胞的免疫抑制性信号分子进行封闭。进一步地，步骤S6中，将步骤S5所得RFF细胞先用磷酸盐缓冲液洗一次，1000rpm离心5min，而后以OKM-200+5％FBS进行重悬。本专利技术具有如下有益效果：本专利技术提供一种新的用于细胞免疫治疗的特异性T细胞，即RFF2细胞，是一种攻防兼备的超级T细胞。本专利技术通过筛选出有效的精准多肽并将其对PBMC细胞进行二次多肽冲击，得到更有特异杀伤作用、攻防一体的T细胞。现有技术中，一般是通过DC细胞递呈T细胞，产生特异杀伤的T细胞；或者用病毒做为载体，通过慢病毒转染技术诱导T细胞的特异性杀伤。在本专利技术中，通过二次多肽冲击技术诱导T细胞的特异性杀伤。首先第一次多肽冲击，用混合多肽直接刺激PBMC细胞；而后筛选精准多肽；再以精准多肽刺激PBMC，并在共培养过程中对PBMC细胞进行多次刺激。通过多次刺激将普通T细胞改造成为具有更精准的杀伤能力的超级T细胞。相比慢病毒转染，简单方便、安全性高。在本申请中，联合多肽冲击和体外扩增，提高T细胞对复杂的肿瘤微环境的适应力。本申请中，联合抗体药物体外封闭防护技术对免疫抑制性信号分子进行体外封闭，在不降低T细胞杀伤力的基础上提高了其自身防护能力。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1示出了本专利技术实施例所述RFF2细胞的构建方法的流程示意图；图2示出了抗原负载效率检测；图3示出了精准多肽筛选结果；图4示出了流式检测特异性T细胞比例；图5示出了免疫抑制性信号分子封闭情况；图6示出了RFF2细胞对肿瘤的杀伤能力；图7示出了RFF2细胞对细胞因子IFN-γ的释放；图8示出了荷瘤小鼠生存曲线。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。如图1所示，本专利技术实施例提供一种RFF2细胞的构建方法，用于构建一种用于细胞免疫治疗的特异性T细胞，命名为RFF2细胞。所述方法包括以下步骤：S1)PBMC细胞(peripheralbloodmononuclearcell，外周血单个核细胞)负载致肿瘤突变的多肽，而后对负载多肽后的PBMC细胞进行多肽冲击；S2)冲击后扩大培养，得到FF细胞；S3)以致肿瘤突变的多肽作为抗原直接刺激所述FF细胞以筛选精准多肽；S4)以步骤S3筛选的精准多肽负载PBMC细胞，而后培养，并在培养过程中，以精准多肽进行多次多肽冲击；S5)冲击后继续培养，得到RFF细胞；S6)用单抗药对步骤S5所得RFF细胞进行免疫抑制性信号分子封闭，以得到RFF2细胞，所述免疫抑制性信号分子包括：PD-1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种RFF2细胞的构建方法，其特征在于，所述构建方法用于构建一种用于细胞免疫治疗的RFF2细胞，所述方法包括以下步骤：S1)PBMC细胞负载致肿瘤突变的多肽，而后对负载多肽后的PBMC细胞进行一次多肽冲击；S2)冲击后扩大培养，以得到FF细胞；S3)以致肿瘤突变的多肽作为抗原直接刺激所述FF细胞以筛选精准多肽；S4)以步骤S3筛选的精准多肽负载PBMC细胞，而后培养，并在培养过程中，以精准多肽进行多次多肽冲击；S5)冲击后继续培养，得到RFF细胞；S6)用单抗药对步骤S5所得RFF细胞进行免疫抑制性信号分子的封闭，以得到RFF2细胞，所述免疫抑制性信号分子包括：PD‑1、Tim‑3、LAG3、CTLA‑4、BTLA、VISTA、CD160、TIGIT、2B4(CD244)。

【技术特征摘要】
1.一种RFF2细胞的构建方法，其特征在于，所述构建方法用于构建一种用于细胞免疫治疗的RFF2细胞，所述方法包括以下步骤：S1)PBMC细胞负载致肿瘤突变的多肽，而后对负载多肽后的PBMC细胞进行一次多肽冲击；S2)冲击后扩大培养，以得到FF细胞；S3)以致肿瘤突变的多肽作为抗原直接刺激所述FF细胞以筛选精准多肽；S4)以步骤S3筛选的精准多肽负载PBMC细胞，而后培养，并在培养过程中，以精准多肽进行多次多肽冲击；S5)冲击后继续培养，得到RFF细胞；S6)用单抗药对步骤S5所得RFF细胞进行免疫抑制性信号分子的封闭，以得到RFF2细胞，所述免疫抑制性信号分子包括：PD-1、Tim-3、LAG3、CTLA-4、BTLA、VISTA、CD160、TIGIT、2B4(CD244)。2.根据权利要求1所述的RFF2细胞的构建方法，其特征在于，在步骤S2中，所述冲击后扩大培养，以得到FF细胞包括：将多肽冲击后的PBMC细胞在预铺细胞刺激因子OKM-25的细胞培养装置中培养；培养一段时间后，转移至含有培养液OKM-100+12％FBS的细胞培养装置中继续培养；培养一段时间后，再转移至含有培养液OKM-200+5％FBS的细胞培养装置中继续培养。3.根据权利要求1所述的RFF2细胞的构建方法，其特征在于，步骤S4中，重复多肽冲击3～4次。4.根据权利要求4所述的RFF2细胞的构建方法，其特征在于，在步骤S4中，每隔3～4天进行一次多肽冲击。5.根据权利要求1所述的RFF2细胞的构建方法，其特征在于，多肽冲击中，用浓度为10μg/mL～100μg/mL的...

【专利技术属性】
技术研发人员：焦顺昌，张嵘，周子珊，解佳森，王海燕，李营营，
申请(专利权)人：北京鼎成肽源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11