扩大T细胞的方法技术

本公开涉及体外扩大自体或异源抗原特异性T细胞的新方法，包括步骤：a)在存在下列的情况下培养自体PCMB细胞群：i)已用与靶抗原相关的肽/肽混合物脉冲的树突细胞或与靶抗原相关的肽/肽混合物，和ii)至少一种细胞因子，和b)在存在下列的情况下培养来自步骤a)的T细胞群：i)已用与靶抗原相关的肽/肽混合物脉冲的树突细胞，或已用与靶抗原相关的肽/肽混合物脉冲的自体抗原递呈T细胞(T‑APC’s)细胞，和人造共同刺激因子，和ii)任选地，细胞因子，并且其特征在于，所述方法在相关T细胞群扩大中不采用活病毒和/或病毒载体或编码抗原的DNA或RNA或重组靶抗原的使用。本公开还扩展至得自所述方法的细胞群、包括所述细胞群的药物组合物和细胞和组合物的治疗用途，特别是治疗或预防病毒感染和/或癌症，例如，在免疫抑制或免疫活性患者体内。

【技术实现步骤摘要】
扩大T细胞的方法本申请是分案申请，原申请的申请日为2012年4月23日、申请号为201280069568.8、专利技术名称为“扩大T细胞的方法”。本申请要求美国临时申请序号61/569,577的优先权，其被引入本文作为参考。
本专利技术涉及扩大T细胞——如自体T细胞、其衍生的细胞群——的新方法、包括所述细胞群的药物组合物和该细胞和组合物用于治疗——特别是治疗或预防病毒感染和/或癌症，例如，免疫抑制或免疫活性人患者——的应用。
技术介绍
虽然病毒被广泛公认是感染性疾病的病因，某些病毒也与人癌症有关。人免疫系统是控制病毒感染以及显示与致癌性病毒相关的恶性肿瘤的中心。在构成人免疫系统的细胞、抗体和免疫调节分子的复杂排列中，胸腺起源的淋巴细胞(T细胞)对于控制病毒感染和癌症具有中心作用。因此，一种预防或治疗病毒感染和癌症的方法已被采用，从这些患者采集T细胞，并将其在体外刺激和/或扩大，然后将其输回患者体内。体内T细胞激活和抗原特异性扩大通常被认为源自两个信号过程，其中第一信号通过T细胞受体/CD3复合物与递呈肽抗原的主要组织相容性复合物I类或II类分子(MHCI类或MHCII类)的连接而产生。MHCI类或MHCII类和肽复合物在细胞(抗原递呈细胞或APC)表面上表达。肽抗原源自进行内生过程的细胞中的分子，并且可以是(1)体内天然存在的“自身”抗原；(2)源自癌症相关突变的肿瘤抗原；或(3)与感染或癌症相关的病毒抗原；等等。T细胞受体识别抗原被认为是第一信号，而第二信号产生自T细胞上另外的表面分子与APC上另外的分子的连接所造成的共同刺激。可能需要T细胞和APC之间的这些共同刺激分子的上调和连接来引起或促进T细胞激活，因为单独的第一信号可能不足以将此实现。这两种信号激活可导致T细胞扩大，使得更大量的抗原特异性T细胞可被利用，以控制引起免疫应答的病原或癌症。对这两种信号激活的权威理解基于相同的APC，其为响应T细胞提供第一信号和第二信号，使得共同刺激与抗原识别直接相关。T细胞的体外激活和扩大一直是漫长的、复杂的和资源密集型的过程。一般的方法可例如耗时8-12周，并且通常利用活“靶”病毒和/或病毒载体来实现抗原递呈细胞(APC)的抗原递呈。通常，T细胞激活/扩大需要静态条件，而非搅拌或物理搅动培养系统。培养识别EB病毒(EpsteinBarrVarus，EBV)的LMP1和LMP2抗原的抗原特异性T细胞的一个现有技术方法可概括如下：预备步骤·为了以可控方式实现两信号T细胞激活和扩大方法，通过取自患者的B细胞的转染生成抗原递呈细胞是可用的。这被称为建立自体类淋巴母细胞细胞系，并且通过用EBV(EBV-LCL)感染细胞进行。其耗时约6-8周以建立该细胞系，因此其是作为依赖于EBV-LCL以进行抗原递呈的培养方法的一部分必须开始的初始阶段之一。其如下制备：在环胞素A存在派生副产物(outgrowth)和LCL消除。ο在利用EBV-LCL的扩大步骤前，培养系统包括，通过已转导有病毒载体Ad5f35-LMP1-LMP2(编码EBV蛋白LMP1和LMP2)的自体树突细胞，初始激活和扩大LMP-1和LMP-2特异性T细胞(第0至8天)。ο第9至12天，收集溶细胞性T淋巴细胞(CTL)，并将其再悬浮于新制培养基中，并用转导有Ad5f35-LMP1-LMP2的EBV-LCL再刺激。ο第13至16天，向溶细胞性T淋巴细胞供给新制培养基和重组人IL-2。ο然后是利用CTL:LCL每周再刺激，和每周两次添加IL-2，持续4至8周时间。·用于该方法的树突细胞也必须通过如下制备：从患者样品获取PBMC，并用IL-4和GM-CSF将其激活，以提供粘附PBMC。然后使这些细胞转导有病毒载体Ad5f35-LMP1-LMP2(即，编码EBV蛋白LMP1和LMP2)。最后，通过添加IL-1β、IL-6、PGE-1和TNF-α使得树突细胞成熟。T细胞扩大步骤概述(也被称为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的制备)·在制备后，将转导的树突细胞与来自患者的新制PBMC一起培养约10天时间。·然后将得自此步骤的T细胞与转导的EBV-LCL一起培养约1周时间。·然后在IL-2存在的情况下将得自后者步骤的T细胞与转导的EBV-LCL一起再培养10天，以提供自体T细胞抗原特异性产物。·反复此过程，直到已扩大足够的T细胞。JImmunotherVol33，Number3，2010年4月描述了更快速并且更有效的培养细胞的方法，其经23天时间，利用来自WilsonWolf的被称为GRexTM系统的系统。但是，这种快速方法仍然对细胞应用传统病毒刺激。现有技术策略具有多个问题：(i)活病毒如EBV和病毒载体的应用有可能引起抗载体免疫显性应答，其可干扰靶病毒特异性CTL’s的有效生成；(ii)活病毒的应用由于安全顾虑是进展至3期试验的障碍；(iii)B细胞制备EBV-LCL的要求，既然利妥昔单抗(Rituxan)(其减少B细胞)已成为大多数淋巴瘤患者的标准治疗，意味着该技术无法用于多数患者；(iv)生产期(最少6周以建立EBV-LCL和另外5至7周以用于CTL扩大)非常不便，不现实并且经济困难；(v)细胞调控的复杂性提供很多产物错误和污染机会，因此，良好生产规范(GMP)的准则难以符合，和(vi)用于刺激T细胞扩大的自体抗原递呈细胞可表达靶抗原之外的抗原，其可降低治疗性T细胞产物所需的抗原特异性T细胞的纯度。然而，技术人员一直不愿从偏离已建立的方法，因为每个步骤都被认为是生成具有治疗性特征的产物，特别是生成适于在体内识别被活病毒感染的细胞和癌症表达病毒抗原的T细胞群所必需的。本公开提供快速和有效生产对靶抗原具有特异性的抗原特异性T细胞的方法。
技术实现思路
本公开提供体外扩大(扩张)抗原特异性T细胞如自体抗原特异性T细胞的方法，包括如下步骤：a)在存在下列的情况下，培养自体PBMC群：i)已用与靶抗原(一种或多种)相关的肽/肽混合物脉冲的树突细胞或与靶抗原(一种或多种)相关的肽/肽混合物，和ii)至少一种细胞因子，和b)在存在下列的情况下，培养得自步骤a)的细胞群：i)已用与靶抗原(一种或多种)相关的肽/肽混合物脉冲的树突细胞，或已用与靶抗原(一种或多种)相关的肽/肽混合物脉冲的自体抗原递呈T细胞(T-APC’s)细胞，和人造共同刺激因子，和ii)任选地，细胞因子，并且其特征在于，该方法在相关T细胞群的扩大中，不应用活病毒和/或病毒载体，或编码抗原的DNA或RNA。在一个实施方式中，提供体外扩大自体抗原特异性T细胞的方法，包括步骤：a)在存在下列的情况下，培养自体PBMC群：i)已用与靶抗原(一种或多种)相关的肽混合物脉冲的树突细胞，和ii)至少一种细胞因子，和b)在存在下列的情况下，培养得自步骤a)的细胞群：i)已用与靶抗原(一种或多种)相关的肽混合物脉冲的自体抗原递呈T细胞(T-APC’s)细胞和人造共同刺激因子，ii)细胞因子，和其特征在于，该方法在相关T细胞群的扩大中不应用活病毒和/或病毒载体或编码抗原的DNA或RNA。在本公开的方法中，步骤a)的PBMC或树突细胞和步骤b)的抗原递呈细胞通常用肽脉冲(也被称为负载)，该肽被选择以显示来自靶抗原的表位。这些肽在下文中得到更详本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.体外扩大抗原特异性T细胞如自体抗原特异性T细胞的方法，包括步骤：a)在存在下列的情况下培养自体PBMC细胞群：i)已用与靶抗原(一种或多种)相关的肽/肽混合物脉冲的树突细胞或与靶抗原(一种或多种)相关的肽/肽混合物，和ii)至少一种细胞因子，和b)在存在下列的情况下培养来自步骤a)的T细胞群：i)已用与靶抗原(一种或多种)相关的肽/肽混合物脉冲的树突细胞，或已用与靶抗原(一种或多种)相关的肽/肽混合物脉冲的自体抗原递呈T细胞(T‑APC’s)细胞以及人造共同刺激因子，和ii)任选地，细胞因子，并且其特征在于，所述方法在相关T细胞群扩大中不采用活病毒和/或病毒载体或编码抗原的DNA或RNA的使用。

【技术特征摘要】
2011.12.12 US 61/569,5771.体外扩大抗原特异性T细胞如自体抗原特异性T细胞的方法，包括步骤：a)在存在下列的情况下培养自体PBMC细胞群：i)已用与靶抗原(一种或多种)相关的肽/肽混合物脉冲的树突细胞或与靶抗原(一种或多种)相关的肽/肽混合物，和ii)至少一种细胞因子，和b)在存在下列的情况下培养来自步骤a)的T细胞群：i)已用与靶抗原(一种或多种)相关的肽/肽混合物脉冲的树突细胞，或已用与靶抗原(一种或多种)相关的肽/肽混合物脉冲的自体抗原递呈T细胞(T-APC’s)细胞以及人造共同刺激因子，和ii)任选地，细胞因子，并且其特征在于，所述方法在相关T细胞群扩大中不采用活病毒和/或病毒载体或编码抗原的DNA或RNA的使用。2.根据权利要求1所述的方法，其中实施步骤b)两次或更多次(如3、4、5次或更多次)，直到获得足够数量的所述相关T细胞群。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤a)的培养进行12天或...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·M·鲁尼，A·M·利恩，J·F·维拉，M·V·尼高，R·L·库纳斯，
申请(专利权)人：细胞药物有限公司，贝勒医学院，
类型：发明
国别省市：英国,GB