本公开涉及体外扩大自体或异源抗原特异性T细胞的新方法，包括步骤：a)在存在下列的情况下培养自体PCMB细胞群：i)已用与靶抗原相关的肽/肽混合物脉冲的树突细胞或与靶抗原相关的肽/肽混合物，和ii)至少一种细胞因子，和b)在存在下列的情况下培养来自步骤a)的T细胞群：i)已用与靶抗原相关的肽/肽混合物脉冲的树突细胞，或已用与靶抗原相关的肽/肽混合物脉冲的自体抗原递呈T细胞(T-APC’s)细胞，和人造共同刺激因子，和ii)任选地，细胞因子，并且其特征在于，所述方法在相关T细胞群扩大中不采用活病毒和/或病毒载体或编码抗原的DNA或RNA或重组靶抗原的使用。本公开还扩展至得自所述方法的细胞群、包括所述细胞群的药物组合物和细胞和组合物的治疗用途，特别是治疗或预防病毒感染和/或癌症，例如，在免疫抑制或免疫活性患者体内。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】扩大T细胞的方法 本申请要求美国临时申请序号61/569, 577的优先权，其被引入本文作为参考。 本专利技术涉及扩大T细胞--如自体T细胞、其衍生的细胞群--的新方法、包括所 述细胞群的药物组合物和该细胞和组合物用于治疗--特别是治疗或预防病毒感染和/或 癌症，例如，免疫抑制或免疫活性人患者--的应用。 专利技术背景 虽然病毒被广泛公认是感染性疾病的病因，某些病毒也与人癌症有关。人免疫系 统是控制病毒感染以及显示与致癌性病毒相关的恶性肿瘤的中心。在构成人免疫系统的细 胞、抗体和免疫调节分子的复杂排列中，胸腺起源的淋巴细胞（T细胞）对于控制病毒感染 和癌症具有中心作用。因此，一种预防或治疗病毒感染和癌症的方法已被采用，从这些患者 采集T细胞，并将其在体外刺激和/或扩大，然后将其输回患者体内。 体内T细胞激活和抗原特异性扩大通常被认为源自两个信号过程，其中第一信号 通过T细胞受体/CD3复合物与递呈肽抗原的主要组织相容性复合物I类或II类分子（MHC I类或MHCII类）的连接而产生。MHCI类或MHCII类和肽复合物在细胞（抗原递呈细 胞或APC)表面上表达。肽抗原源自进行内生过程的细胞中的分子，并且可以是（1)体内天 然存在的"自身"抗原；（2)源自癌症相关突变的肿瘤抗原；或⑶与感染或癌症相关的病 毒抗原；等等。T细胞受体识别抗原被认为是第一信号，而第二信号产生自T细胞上另外的 表面分子与APC上另外的分子的连接所造成的共同刺激。可能需要T细胞和APC之间的这 些共同刺激分子的上调和连接来引起或促进T细胞激活，因为单独的第一信号可能不足以 将此实现。这两种信号激活可导致T细胞扩大，使得更大量的抗原特异性T细胞可被利用， 以控制引起免疫应答的病原或癌症。对这两种信号激活的权威理解基于相同的APC，其为响 应T细胞提供第一信号和第二信号，使得共同刺激与抗原识别直接相关。T细胞的体外激活 和扩大一直是漫长的、复杂的和资源密集型的过程。一般的方法可例如耗时8-12周，并且 通常利用活"靶"病毒和/或病毒载体来实现抗原递呈细胞（APC)的抗原递呈。通常，T细 胞激活/扩大需要静态条件，而非搅拌或物理搅动培养系统。 培养识别EB病毒（EpsteinBarrVarus，EBV)的LMP1和LMP2抗原的抗原特异性 T细胞的一个现有技术方法可概括如下： 预备步骤 ?为了以可控方式实现两信号T细胞激活和扩大方法，通过取自患者的B细胞 的转染生成抗原递呈细胞是可用的。这被称为建立自体类淋巴母细胞细胞系，并且通过 用EBV(EBV-LCL)感染细胞进行。其耗时约6-8周以建立该细胞系，因此其是作为依赖于 EBV-LCL以进行抗原递呈的培养方法的一部分必须开始的初始阶段之一。其如下制备：在 环胞素A存在派生副产物（outgrowth)和LCL消除。 0在利用EBV-LCL的扩大步骤前，培养系统包括，通过已转导有病毒载体 Ad5f35-LMP1-LMP2 (编码EBV蛋白LMP1和LMP2)的自体树突细胞，初始激活和扩大LMP-1 和LMP-2特异性T细胞（第0至8天）。〇第9至12天，收集溶细胞性T淋巴细胞（CTL)，并将其再悬浮于新制培养基中， 并用转导有Ad5f35-LMP1-LMP2的EBV-LCL再刺激。 〇第13至16天，向溶细胞性T淋巴细胞供给新制培养基和重组人IL-2。 〇然后是利用CTL:LCL每周再刺激，和每周两次添加IL-2,持续4至8周时间。 〇用于该方法的树突细胞也必须通过如下制备：从患者样品获取PBMC，并 用IL-4和GM-CSF将其激活，以提供粘附PBMC。然后使这些细胞转导有病毒载体 Ad5f35-LMP1-LMP2(即，编码EBV蛋白LMP1 和LMP2)。最后，通过添加IL-1P、IL-6、PGE-1 和TNF-a使得树突细胞成熟。T细胞扩大步骤概述(也被称为细胞毒性T淋巴细胞（CTL)的制备） ?在制备后，将转导的树突细胞与来自患者的新制PBMC-起培养约10天时间。 ?然后将得自此步骤的T细胞与转导的EBV-LCL-起培养约1周时间。 ?然后在IL-2存在的情况下将得自后者步骤的T细胞与转导的EBV-LCL-起再培 养10天，以提供自体T细胞抗原特异性产物。 ?反复此过程，直到已扩大足够的T细胞。 JImmunotherVol33，Number3,2010年4月描述了更快速并且更有效的培养细 胞的方法，其经23天时间，利用来自WilsonWolf的被称为GRex?系统的系统。但是，这种 快速方法仍然对细胞应用传统病毒刺激。 现有技术策略具有多个问题： (i)活病毒如EBV和病毒载体的应用有可能引起抗载体免疫显性应答，其可干扰 靶病毒特异性CTL's的有效生成； (ii)活病毒的应用由于安全顾虑是进展至3期试验的障碍； (iii)B细胞制备EBV-LCL的要求，既然利妥昔单抗（Rituxan)(其减少B细胞）已 成为大多数淋巴瘤患者的标准治疗，意味着该技术无法用于多数患者； (iv)生产期（最少6周以建立EBV-LCL和另外5至7周以用于CTL扩大）非常不 便，不现实并且经济困难； (v)细胞调控的复杂性提供很多产物错误和污染机会，因此，良好生产规范（GMP) 的准则难以符合，和 (vi)用于刺激T细胞扩大的自体抗原递呈细胞可表达靶抗原之外的抗原，其可降 低治疗性T细胞产物所需的抗原特异性T细胞的纯度。 然而，技术人员一直不愿从偏离已建立的方法，因为每个步骤都被认为是生成具 有治疗性特征的产物，特别是生成适于在体内识别被活病毒感染的细胞和癌症表达病毒抗 原的T细胞群所必需的。 本公开提供快速和有效生产对靶抗原具有特异性的抗原特异性T细胞的方法。 专利技术概述 本公开提供体外扩大（扩张）抗原特异性T细胞如自体抗原特异性T细胞的方法， 包括如下步骤：a)在存在下列的情况下，培养自体PBMC群： i)已用与靶抗原（一种或多种）相关的肽/肽混合物脉冲的树突细胞或与靶抗原 (一种或多种）相关的肽/肽混合物，和 ii)至少一种细胞因子，和 b)在存在下列的情况下，培养得自步骤a)的细胞群： i)已用与靶抗原（一种或多种）相关的肽/肽混合物脉冲的树突细胞，或已用与 靶抗原（一种或多种）相关的肽/肽混合物脉冲的自体抗原递呈T细胞（T-APC's)细胞， 和人造共同刺激因子，和 ii)任选地，细胞因子，并且 其特征在于，该方法在相关T细胞群的扩大中，不应用活病毒和/或病毒载体，或 编码抗原的DNA或RNA。 在一个实施方式中，提供体外扩大自体抗原特异性T细胞的方法，包括步骤： a)在存在下列的情况下，培养自体PBMC群： i)已用与靶抗原（一种或多种）相关的肽混合物脉冲的树突细胞，和 ii)至少一种细胞因子，和 b)在存在下列的情况下，培养得自步骤a)的细胞群： i)已用与靶抗原（一种或多种）相关的肽混合物脉冲的自体抗原递呈T细胞 (T-APC's)细胞和人造共同刺激因子， ii)细胞因子，和 其特征在于，该方法在相关T细胞群的扩大中不应用活病毒和/或病毒载体或编 码抗原的DNA或RNA。 在本公开的方法中，步骤a)的PBMC或树突细胞和步骤b)的抗原递呈细胞通常用 肽脉冲（也被称为负载本文档来自技高网...
【技术保护点】
体外扩大抗原特异性T细胞如自体抗原特异性T细胞的方法，包括步骤：a)在存在下列的情况下培养自体PBMC细胞群：i)已用与靶抗原(一种或多种)相关的肽/肽混合物脉冲的树突细胞或与靶抗原(一种或多种)相关的肽/肽混合物，和ii)至少一种细胞因子，和b)在存在下列的情况下培养来自步骤a)的T细胞群：i)已用与靶抗原(一种或多种)相关的肽/肽混合物脉冲的树突细胞，或已用与靶抗原(一种或多种)相关的肽/肽混合物脉冲的自体抗原递呈T细胞(T‑APC’s)细胞以及人造共同刺激因子，和ii)任选地，细胞因子，并且其特征在于，所述方法在相关T细胞群扩大中不采用活病毒和/或病毒载体或编码抗原的DNA或RNA的使用。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：C·M·鲁尼，A·M·利恩，J·F·维拉，M·V·尼高，R·L·库纳斯，
申请(专利权)人：细胞药物有限公司，贝勒医学院，
类型：发明
国别省市：英国;GB
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