用于治疗结直肠肿瘤的CD8+细胞毒性T淋巴细胞及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种用于治疗结直肠肿瘤的CD8+细胞毒性T淋巴细胞的制备方法。本发明专利技术所提供的方法包括如下步骤：将负载CEA610D多肽的B细胞与CD8+T细胞在体外共培养，使所述CD8+T细胞活化，从而获得用于治疗结直肠肿瘤的CD8+细胞毒性T淋巴细胞；所述CEA610D多肽的氨基酸序列为序列表中序列1。本发明专利技术通过在体外制备大量CEA抗原特异性CD8+CTL，并联合胸腺肽α1，两者作用互补，起到了协同增效的作用，极大提高了对肿瘤的杀伤效率，对常规治疗无法清除的残留肿瘤细胞进行杀灭，有效防止肿瘤的复发和转移。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及一种用于治疗结直肠肿瘤的⑶8+细胞毒性T淋巴 细胞及其制备方法。
技术介绍
结直肠癌（包括结肠癌、直肠癌和肛门癌）是常见的消化道恶性肿瘤，在全球范围 内为男性第3位、女性第2位高发性恶性肿瘤，每年新发约120万例，死亡约60万例。随着 社会经济发展、居民生活方式的转变，以及人口老龄化的加剧，我国结直肠癌的发病和死亡 呈明显上升趋势，且发病年龄有所提前。随着手术、化疗及放疗等传统的肿瘤治疗方法的规 范化，结直肠恶性肿瘤患者的生存期已经得到明显延长，但传统的治疗方法并不能完全治 愈肿瘤，而且对机体抗肿瘤免疫功能也造成一定的损伤。 随着从细胞和分子水平上对肿瘤免疫研宄的深入，免疫治疗已经在前列腺癌、胃 癌、黑色素瘤等实体肿瘤治疗方面取得显著疗效，基于抗肿瘤特异性免疫重建的免疫治疗 是目前国际上公认的继手术、放疗和化疗之后最有希望完全消灭体内肿瘤细胞并根治的目 的，将成为未来肿瘤治疗的一个主要方向。T淋巴细胞作为免疫细胞治疗的主要效应细胞， 可特异性识别肿瘤，呈克隆化扩增并在体内形成免疫记忆，介导持久抗肿瘤特异性免疫效 应。通过提高病人自身免疫系统的功能，增强特异性肿瘤杀伤细胞的分化能力，在细胞水平 上杀伤肿瘤细胞，有效抑制肿瘤细胞的转移、扩散和复发，且副反应轻微具有良好的临床治 疗效果，克服了肿瘤传统治疗方式的"不彻底、易转移、副作用大"等弊端。通常认为培养后 产生的CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTL)在人体内起了主要杀伤肿瘤细胞的作用。CD8+CTL 细胞可识别肿瘤细胞表面的肿瘤抗原肽-MHC I类分子复合物，被激活后增殖、分化并通过 Fasl/Fas、颗粒酶等多种途径在荷瘤早期、肿瘤缓解期或术后残余瘤细胞中杀伤肿瘤细胞。 而CD8+CTL细胞的激活需要肿瘤抗原致敏和抗原递呈细胞（APC)所提供的共刺激信号以及 由细胞因子提供的第三类信号分子的共同作用。 B细胞作为一种APC，在外周血中的比例约6. 4~22%，与目前常用的树突状细胞 (DC细胞）相比较，数量远高于DCs (约占0. 16~0. 68 % )，且DCs体外分离和纯化较困难， 而B细胞在体外通过⑶40L刺激后可被大量扩增，且培养体系更加简单、经济。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种用于治疗结直肠肿瘤的⑶8+细胞毒性T淋巴细胞 及其制备方法。 本专利技术所提供的用于治疗结直肠肿瘤的CD8+细胞毒性T淋巴细胞的制备方法，具 体可包括如下步骤：将负载CEA61cid多肽的B细胞（离体）与CD8 +T细胞（离体）在体外共 培养，使所述CD8+T细胞活化，从而获得用于治疗结直肠肿瘤的CD8+细胞毒性T淋巴细胞； 所述CEA 61cid多肽的氨基酸序列为序列表中序列1，即氨基酸单字母缩写序列是YLSGADLNL。 在本专利技术方法中，进行所述体外共培养时，所述负载了 CEA61cid多肽的B细胞与所述 CD8+T细胞的配比（即细胞的数目比）可为1:10-1:50,优选为1:20 ;进行所述体外共培养 的时间为7-8天，优选为7天。 在本专利技术方法中，所述负载CEA61cid多肽的B细胞可按照包括如下步骤的方法制备 得到： (1)从离体人外周血单个核细胞（PBMC)中分离B细胞，采用含有rhIL-4和s⑶40L 的培养液培养所得B细胞，培养4-8天，使所述B细胞活化； 其中，rhIL-4在所述培养液中的浓度为l-10ng/ml，优选为5ng/ml ;sQ)40L在所述 培养液中的浓度为1-10 μ g/ml，优选为5 μ g/ml。另外，所述培养液中还含有人AB血清，浓 度为1-20%体积分数，优选为10%体积分数；转铁蛋白，浓度为1-20 μ g/ml，优选为10 μ g/ ml ;和胰岛素，浓度为1-20 μ g/ml，优选为10 μ g/ml。 活化后的B细胞表现为：增殖活跃，且细胞表面高表达⑶80、⑶86、MHC等抗原递 呈相关分子。 (2)向培养有步骤⑴获得的已活化的B细胞的培养液（同步骤⑴培养液配方） 中加入所述CEA 61cid多肽，继续培养，培养12-18h，使所述CEA 61(1)多肽负载到所述B细胞上， 即获得所述负载CEA61cid多肽的B细胞。 其中，所述CEA61cid多肽的加入量满足如下条件：加入所述CEA61cid多肽后，所述 CEA61cid多肽在培养体系中的浓度为30-80 μ g/ml，优选50 μ g/ml。 本专利技术方法中，所述"将负载CEA_多肽的B细胞与CD8 +T细胞在体外共培养"是 在滋养层细胞上进行共培养的。所述滋养层细胞具体为所述人外周血单个核细胞（PBMC) 中的CD81fe附细胞（非CD8粘附细胞）。 所述⑶8?附细胞（非⑶8粘附细胞）的作用是刺激⑶8 +细胞毒性T淋巴细胞 扩增。 由本专利技术方法制备得到的CD8+细胞毒性T淋巴细胞以及由所述方法制备得到的 含有所述CD8+细胞毒性T淋巴细胞的整个共培养体系中全部细胞也属于本专利技术的保护范 围。 本专利技术所述的CD8+细胞毒性T淋巴细胞以及由所述方法制备得到的含有所述CD8 + 细胞毒性T淋巴细胞的整个共培养体系中全部细胞在制备用于治疗结直肠肿瘤的产品中 的应用也属于本专利技术的保护范围。 本专利技术的另一个目的是提供一种用于治疗结直肠肿瘤的制剂。 本专利技术所提供的用于治疗结直肠肿瘤的制剂含有本专利技术方法制备的CD8+细胞毒 性T淋巴细胞和胸腺肽α 1。 在本专利技术制剂中，所述的CD8+细胞毒性T淋巴细胞或者由所述方法制备得到的含 有所述CD8+细胞毒性T淋巴细胞的整个共培养体系中全部细胞和所述胸腺肽α 1的配比 为6Χ 106-9Χ IO6个本专利技术CD8 +细胞毒性T淋巴细胞：5-20 μ g胸腺肽α 1，优选8Χ 10 6个 本专利技术⑶8+细胞毒性T淋巴细胞：10 μ g胸腺肽α 1。 在本专利技术的一个实施例中，本专利技术所述制剂的组成如下：每毫升所述制剂中含有 6 X 106-9 X IO6个本专利技术CD8 +细胞毒性T淋巴细胞，5-20 μ g胸腺肽α 1，余量为含有l-20g/ L，优选为10g/L人血白蛋白的生理盐水，所述生理盐水中NaCl的质量分数为0. 9%。优选 地，本专利技术所述制剂的组成如下：每毫升所述制剂中含有8X IO6个本专利技术CD8 +细胞毒性T 淋巴细胞，10以8胸腺肽〇1，余量为含有1-2(^/1，优选为1(^/1人血白蛋白的生理盐水，所 述生理盐水中NaCl的质量分数为0. 9%。 在本专利技术制剂中，也可以以所述"由本专利技术方法制备得到的含有本专利技术CD8+细胞 毒性T淋巴细胞的整个共培养体系中全部细胞"替代"本专利技术所述CD8+细胞毒性T淋巴细 胞"。 本专利技术的再一个目的是提供一种负载CEA61cid多肽的B细胞。 本专利技术所提供的负载CEA61cid多肽的B细胞，具体为负载了氨基酸序列为序列表中 序列1多肽（所述CEA 61qd多肽）的B细胞。 所述负载CEA61cid多肽的B细胞可按照前文所述方法制备得到。 所述负载CEA61cid多肽的B细胞在制备所述CD8 +细胞毒性T淋巴细胞或者由所述 方法制备得到的含有所述CD8+细胞毒性T淋巴细胞的整个共培养体系中全部细胞中的应 用也属于本专利技术的保护范围。 本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于治疗结直肠肿瘤的CD8+细胞毒性T淋巴细胞的制备方法，包括如下步骤：将负载CEA610D多肽的B细胞与CD8+T细胞在体外共培养，使所述CD8+T细胞活化，从而获得用于治疗结直肠肿瘤的CD8+细胞毒性T淋巴细胞；其中所述CEA610D多肽的氨基酸序列为YLSGADLNL。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘静维，卢戌，王跃，
申请(专利权)人：北京康爱瑞浩生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11