一种体外诱导扩增NK细胞的方法技术

本发明专利技术提供一种体外诱导扩增NK细胞的方法，包括向NK细胞培养液中添加三叶青提取物，所述的三叶青提取物的浓度为0.00625μg/ml~9.76μg/ml，所述的三叶青提取物为三叶青总提取物Th-t、水煮脱糖部位Th-w3、石油醚部位Th-p或水部位脱糖部位Th-w2；本方法可在体外培养条件下获得大量的、应用安全的、纯度较高的以及杀伤活性强的NK细胞，从而使得该细胞达到能够安全有效的应用于临床的质量指标，同时该方法操作简便，成本低，适用于大规模应用；利用本方法所获得的NK细胞，在细胞数量、纯度、杀伤活性、细胞因子分泌水平均有显著提高，利用本方法培养，细胞数量提高了几千倍。

【技术实现步骤摘要】
一种体外诱导扩增NK细胞的方法
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及利用三叶青提取物的一种体外诱导扩增NK细胞的方法。
技术介绍
近年来，肿瘤的生物治疗已经成为肿瘤治疗领域研究的热点。NK细胞是一类独立的淋巴细胞群，NK细胞主要通过细胞毒活性而显示生物学效应，可直接杀伤肿瘤细胞、病毒感染的细胞，胞内寄生菌等。NK细胞可以识别自身正常细胞和异常组织细胞，其仅杀伤异常细胞而对宿主正常组织细胞没有细胞毒作用。此外，NK细胞通过分泌多种细胞因子，在免疫调节和某些免疫细胞分化中发挥重要作用。NK细胞主要以组织相容性复合物(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)非限制性方式识别肿瘤，通过颗粒酶B(granzymeB)和穿孔素(perforin)等途径杀伤肿瘤细胞，而T细胞表面的CD107aPb分子，与T细胞活化以后脱颗粒过程相关，其比值可以直接反应该效应细胞具有的特异性杀伤活性。同时，NK细胞还能与其它固有免疫细胞和适应性免疫细胞相互作用，协同发挥抗肿瘤作用。目前NK细胞已经成为肿瘤患者过继免疫治疗的重要效应细胞。由此可见，为满足生物学功能研究和临床过继细胞免疫治疗需要，扩增出高效和较多数量的NK细胞是许多学者共同研究的课题。现阶段体外扩增NK细胞主要采取饲养层细胞共培养法和免疫磁珠分选法，但饲养层细胞共培养是将NK细胞添加到经改造后的肿瘤细胞株，这样改造在临床上应用的安全性没有得到保障，而免疫磁珠分选法操作过程繁琐，成本高，不适合临床大规模应用。
技术实现思路
：为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种体外诱导扩增NK细胞的方法，可在体外培养条件下获得大量的、应用安全的、纯度较高的以及杀伤活性强的NK细胞，从而使得该细胞达到能够安全有效的应用于临床的质量指标。为实现该专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：一种体外诱导扩增NK细胞的方法，包括向NK细胞培养液中添加三叶青提取物，所述的三叶青提取物的浓度为0.00625μg/ml～9.76μgg/ml。更具体的，本专利技术的体外诱导扩增NK细胞的方法，包括以下步骤：(1)单个核细胞分离：静脉穿刺采集患者外周血，转移至含肝素钠的抗凝瓶中，上下混匀，将外周血样本移至离心管进行离心，弃上层血浆，生理盐水稀释血样，淋巴分离液分离单个核细胞，生理盐水重悬单个核细胞，离心收集单个核细胞；(2)细胞种瓶：将上述单个核细胞用含rhIL-2的NK细胞培养液稀释至NK细胞浓度为2×105～1×106/ml，接种于6孔细胞培养板中，毎孔5ml，于37℃、5％CO2培养箱培养；(3)细胞扩增：每2天半量换液1次，并调整细胞密度为4×104～6×104/mL，NK细胞培养至第7天，向培养液中添加三叶青提取物，浓度为0.00625μg/ml～9.76μg/ml，此后继续培养；(4)细胞收集：培养3至21天，收集培养的NK细胞。优选的，步骤(2)中的rhIL-2的浓度为500U/ml。优选的，步骤(2)中NK细胞浓度为3.5×105ml。优选的，步骤(3)中调整细胞密度为5×104/ml。优选的，步骤(3)中三叶青提取物的浓度为0.01μg/ml～2.44μg/ml。优选的，所述的三叶青提取物为三叶青总提取物，其制备方法为用乙醇溶液加热回流三叶青而提取得到的。优选的，所述的三叶青提取物为水煮脱糖部位Th-w3，其制备方法为经有机溶剂提取后的三叶青药材用水煮后减压回收蒸干。优选的，所述的三叶青提取物为石油醚部位Th-p，取三叶青总提取物，用石油醚进行分步萃取得到。优选的，所述的三叶青提取物为水部位脱糖部位Th-w2，其制备方法为三叶青总提取物的水部位除去糖分，用30％乙醇水洗脱溶液蒸干后得到。本专利技术通过向NK细胞培养液中加入三叶青提取物扩增自然杀伤细胞的方法的在于：三叶青的有效成分主要为含黄酮类化学成份，其性凉，味辛、苦，无毒，具有清热解毒、活血止痛、祛风化痰、活血止痛等功效，常用于高热惊厥，小儿感冒发热、喉痒肿痛、咳嗽、肺炎、肝炎、肠炎、痢疾等疾病。现代药理研究表明，三叶青提取物具有较好的抗肿瘤、抗炎、镇痛及解热作用等。本专利技术人通过对三叶青的成分进行提取分离和鉴定分析,发现不同部位的三叶青提取物，只要很低的剂量即能明显促进人NK细胞增殖，提高NK细胞的杀瘤活性。本专利技术从大规模生产的可操作性，临床应用安全性以及有效性角度出发，优化出三叶青提取物诱导NK细胞的最佳方案，与其他方法相比，本专利技术有以下优点：1.本方法可在体外培养条件下获得大量的、应用安全的、纯度较高的以及杀伤活性强的NK细胞，从而使得该细胞达到能够安全有效的应用于临床的质量指标，同时该方法操作简便，成本低，适用于大规模应用；2.利用本专利技术所获得的NK细胞，在细胞数量、纯度、杀伤活性、细胞因子分泌水平均有显著提高，利用本方法培养，细胞数量提高了几千倍。附图说明图1.三叶青提取技术路线图；图2.不同浓度三叶青提取物TH-t对NK细胞增殖影响图；图3.不同浓度三叶青提取物TH-p对NK细胞增殖影响图；图4.不同浓度三叶青提取物TH-a对NK细胞增殖影响图；图5.不同浓度三叶青提取物TH-b对NK细胞增殖影响图；图6.不同浓度三叶青提取物TH-w对NK细胞增殖影响图；图7.不同浓度三叶青提取物TH-w1对NK细胞增殖影响图；图8.不同浓度三叶青提取物TH-w2对NK细胞增殖影响图；图9.不同浓度三叶青提取物TH-w3对NK细胞增殖影响图；图10.浓度0.62μg/ml的三叶青提取物Th-t对NK细胞增殖影响图；图11.浓度0.62μg/ml三叶青提取物Th-p对NK细胞增殖影响图；图12.浓度0.166μg/ml三叶青提取物Th-W2对NK细胞增殖影响图；图13.浓度0.62μg/ml三叶青提取物Th-W3对NK细胞增殖影响图；图14.三叶青总提取物诱导的NK细胞对三株肿瘤细胞杀伤活性图；图15.0.15μg/ml三叶青总提取物(TH-t)诱导后的NK细胞颗粒酶、穿孔素和CD107a的表达图。具体实施方式为了使本领域的技术人员更好地理解本专利技术的技术方案，下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的详细说明。实施例1：三叶青药材提取分离实验提取液分组：根据提取时所选用的制剂将提取液分为9组，分别命名为：TH-t、TH-p、TH-a、TH-b、TH-w、TH-w1、TH-w2、TH-w3和TH-w4；各组三叶青提取物的提取方法：参照文献[杨阳.甘西鼠尾草及头花蓼化学成分研究.第二军医大学硕士学位论文.上海：第二军医大学，2009]分离纯化得到，经高效液相色谱(HPLC)检查。可参考图1关于三叶青提取技术路线图。TH-t部分：取三叶青干燥药材200g，加5倍体积80％乙醇水溶液浸泡24h后，加热回流提取，共3次，每次40min，合并提取液，过滤，减压回收蒸干，得总提取物TH-t21.6g，得率10.8％。TH-p部分：取此总提取，加水混悬，分别采用10倍体积的石油醚(水饱和)进行分步萃取。分别得到石油醚部位TH-p0.15g，得率0.075％。TH-a部分：乙酸乙酯部位TH-a0.58g，得率0.29％TH-b部分：正丁醇部位TH-b2g，得率1％TH-w部分：以及水部位TH-w18.9g，得率9.45％TH-w1部分：取水本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种体外诱导扩增NK细胞的方法，其特征在于包括向NK细胞培养液中添加三叶青提取物，所述的三叶青提取物的浓度为0.00625μg/ml～9.76μg/ml。

【技术特征摘要】
1.一种体外诱导扩增NK细胞的方法，其特征在于包括向NK细胞培养液中添加三叶青提取物，所述的三叶青提取物的浓度为0.00625μg/ml～9.76μg/ml；所述三叶青提取物为三叶青总提取物，其制备方法为取三叶青干燥药材，加5倍体积80％乙醇水溶液浸泡24h后，加热回流提取，共3次，每次40min，合并提取液，过滤，减压回收蒸干，得三叶青总提取物；或者，所述三叶青提取物为水煮脱糖部位Th-w3，其制备方法为：取三叶青干燥药材200g，加5倍体积80％乙醇水溶液浸泡24h后，加热回流提取，共3次，每次40min，合并提取液，除去提取液后的三叶青药材用水煮后减压回收蒸干，获得脱水物2.1克；或者，所述三叶青提取物为石油醚部位Th-p，取三叶青总提取物，加水混悬，采用10倍体积的水饱和石油醚进行萃取，得到石油醚部位TH-p；或者，所述三叶青提取物为Th-w2，其制备方法为：取三叶青干燥药材200g，加5倍体积80％乙醇水溶液浸泡24h后，加热回流提取，共3次，每次40min，合并提取液，过滤，减压回收蒸干，得总提取物TH-t21.6g，取此总提取，加水混悬，采用10倍体积的水饱和石油醚，进行萃取，得到石油醚部位TH-p0.15g，用乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯部位TH-a0.58g，用正丁醇萃取得到正丁醇部位TH-b2g，以及水部位TH-w，取水部位TH-w进行大孔吸附树脂色谱，先使用纯水进行洗脱，除去糖分，再使用10％、30％、60％、95％乙醇水溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘军权，陈锦阳，杨阳，
申请(专利权)人：杭州中德贝尔生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33