一种人体细胞外泌体工业化制备方法、质量研究及应用技术

本发明专利技术涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种优化的从胎儿附属物（脐血、脐带、胎盘等）、毛囊、脂肪和牙髓、跟腱等中分离培养间充质干细胞（MSC）；3D培养间充质干细胞；从人外周血和脐血中分离制备DC、CIK、NK、TCM、TSCM，CAT‑T、TCR‑T、UCART、TIL、Treg等免疫细胞；从诱导多能干细胞和胚胎干细胞中分离制备外泌体的方法及应用。本发明专利技术使用浓缩和差速离心法结合从细胞上清液中提取外泌体，优化并建立了外泌体工艺和质量标准，提高了产量，为其实现工业化生产应用创造了条件。

【技术实现步骤摘要】
一种人体细胞外泌体工业化制备方法、质量研究及应用
本专利技术涉及细胞培养
，具体涉及一种优化的从胎儿附属物（脐血、脐带、胎盘等）、毛囊、脂肪和牙髓、跟腱等中分离培养间充质干细胞（MSC）；3D培养间充质干细胞；从人外周血和脐血中分离制备DC、CIK、NK、TCM、TSCM，CAT-T、TCR-T、UCART、TIL、Treg等免疫细胞；从诱导多能干细胞和胚胎干细胞中分离制备外泌体的方法及应用。
技术介绍
人间充质干细胞(humanMSCs,hMSCs)是一类具有一定的自我复制更新和多向分化潜能的成体干细胞，广泛存在于胎儿和成人各组织中，如骨髓、脂肪、皮肤、牙髓、肌腱，以及新生儿附属组织，如脐带、胎盘、羊膜等等组织。除一定程度的分化潜能外，hMSCs还具有独特的免疫调控和组织再生功能，参与调控异常免疫反应、维护免疫平衡，帮助机体形成有利于病损组织细胞修复或再生的微环境，以促进损伤组织细胞的修复或再生，但其发挥作用的机制目前还不明确，最初认为脐带间充质干细胞植入人体后归巢到受损部位，进行细胞自我更新和定向分化，但后续研究表明移植的细胞大部分发生了凋亡，归巢到损伤部位的细胞和分化为靶细胞的数量有限，不能充分解释其组织修复现象，现在越来越多的研究认为脐带间充质干细胞是通过旁分泌机制分泌大量的细胞因子作用于受损部位，进而促进组织修复。外泌体是细胞经过“内吞-融合-外排”等一系列调控过程形成的直径40-100nm的膜性脂质小囊泡，其内含有功能性蛋白质、mRNA及microRNA等物质，在细胞间的信息传递过程中发挥重要作用，广泛参与机体损伤组织修复、基因交换、抗原呈递免疫反应、肿瘤转移等生理病理过程。外泌体可通过配体-受体相互作用的方式粘附到受体细胞表面，亦可通过受体细胞内吞摄取或通过囊泡和细胞膜的直接融合使外泌体内容物释放到靶细胞内，发挥细胞间的通讯作用，从而调节靶细胞的生物学行为。与细胞相比，细胞分泌的外泌体更稳定，更安全，保存更方便，质量更好控制，有望成为一种新的治疗方法。目前提取外泌体的方法主要有超高速离心法、密度梯度离心法、免疫磁珠法、试剂盒法、色谱法等，难以工业化生产，研究一种高效的，可以工业化生产的，高纯度的细胞外泌体的制备方法尤为重要。
技术实现思路
使用浓缩和差速离心法结合从细胞上清液中提取外泌体，应用电镜NanoSight粒径分析、WesternBlotblot方法对细胞上清液来源外泌体的生物学特性进行检测与分析，并对外泌体工业化生产工艺进行质量控制。本专利技术是通过以下步骤得到的：1.人体细胞来源外泌体的制备：用本人专利技术的MSC培养试剂盒（申请号2019107271592）培养人脐带间充质干细胞，血清培养体系下细胞的融合度达到70-80％时更换为无血清培养基继续培养24-48h，收集培养上清液；2．超滤法：（1）收集细胞上清液分装至50ml离心管，1500rpm，10min；（2）离心结束后，用20ml注射器吸取上清，用0.45μm针头滤器过滤；（3）取新的20ml注射器吸取过滤后的液体，用0.22μm针头滤器过滤；（4）过滤液加入超滤管内，3000g、15min；（5）离心结束后，去除外管液体，并往内管添加过滤液，3000g，根据情况调整离心时间，单次不超过2H，直到理想浓度体积；（6）收集内管的浓缩液并转移至新的15ml离心管，-80℃冻存备用。3.超速离心法：（1）收集浓缩液分装至50ml离心管；（2）300g离心10min，去除完整细胞；（3）2000g离心20min，进一步去除死细胞和杂质；（4）10000g离心30min，去除细胞碎片；（5）100000g离心70min，弃上清，沉淀用50ulPBS重悬。4.电镜检测：（1）取材：吸取2.5μl提取的细胞上清外泌体；（2）固定：2.5%戊二醛，磷酸缓冲液配制固定2小时；用0.1M磷酸漂洗液漂洗三次；1%饿酸固定液固定2小时；用0.1M磷酸漂洗液漂洗三次；（3）脱水：50%乙醇15分钟；70%乙醇15分钟；90%乙醇15分钟；90%乙醇90%丙酮（1:1）15分钟；90%丙酮15分钟；100%丙酮15分钟，三次；（4）包埋：纯丙酮+包埋液（2:1）室温3小时；纯丙酮+包埋液（1:2）室温过夜；纯包埋液37度2小时；（5）固化：37度烘箱内过夜；45度烘箱内过夜；60度烘箱内过夜；（6）超薄切片机切片；（7）透射电镜观察，拍片。5.WesternBlotblot检测将获得的外泌体进行蛋白抽提后进行WesternBlotblot检测，其表达外泌体特异性蛋白Alix,CD63及CD9。6.外泌体质量控制内毒素检测阴性、真细菌、支原体、细胞内、外病毒因子检测、细胞因子残留量、BSA残留量和抗生素残留量检测合格。所述制备的细胞外泌体的质量控制鉴定方法，根据《药品生产质量管理规范》（GMP）、《细胞制品研究与评价技术指导原则》(征求意见稿)以及2015版《中国药典》通则9203——药品微生物实验室质量管理指导原则所规定的内容，建立外泌体的质量标准，保证应用时的安全性。上述方法中，在获得本专利技术外泌体之前，用生理盐水洗涤并重悬所述外泌体2-3次，直至满足《中国药典》要求的无菌、内毒素和残留量的检测指标，保证本专利技术的外泌体在回输给患者时残留的本专利技术所述的培养基组分不会引起患者不适反应。本专利技术提供了一种细胞外泌体在临床试验中的应用方法，其中包括让患者知晓本专利技术细胞外泌体的治疗作用并签署知情同意书后，自由选择本专利技术细胞外泌体在临床试验及治疗中的联合应用。本专利技术所述外泌体来源包括但不限于血液、眼泪、尿液、唾液、乳汁、腹水等，细胞来源包括但不限于胎儿附属物（脐血、脐带、胎盘等）、毛囊、脂肪和牙髓、跟腱等中分离培养间充质干细胞（MSC）；3D培养间充质干细胞；人外周血和脐血中分离制备DC、CIK、NK、TCM、TSCM，CAT-T、TCR-T、UCART、TIL、Treg等免疫细胞；诱导多能干细胞和胚胎干细胞等。本专利技术所述细胞外泌体的应用范围包括但不限于护肤品领域，用于修复皮肤损伤，制备具有美白、祛斑、防衰老等功效的护肤品和包括但不限于以下疾病领域：脊髓损伤、心脏损伤、骨、软骨、关节损伤、肝脏损伤；系统性红斑狼疮、银屑病；脑瘫、肌萎缩侧索硬化症、系统性硬化症、克隆氏病、中风、糖尿病、糖尿病足等组织损伤修复，自身免疫性疾病和神经系统疾病等。本专利技术的有益效果：1）本专利技术建立了一种人体细胞来源外泌体工业化制备方法，为其标准化使用建立标准和规范化管理体系；2）本专利技术对人体细胞来源外泌体制备及产品质量控制进行了优化和完善，通过浓缩和超速离心结合，提高外泌体得率，降低生产本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种优化的从胎儿附属物（脐血、脐带、胎盘等）、毛囊、脂肪和牙髓、跟腱等中分离培养间充质干细胞（MSC）；3D培养间充质干细胞；从人外周血和脐血中分离制备DC、CIK、NK、TCM、TSCM，CAT-T、TCR-T、UCART、TIL、Treg等免疫细胞；从诱导多能干细胞和胚胎干细胞中分离制备外泌体的方法及应用：/n（1）人体细胞来源外泌体的制备：/n用本人专利技术的MSC培养试剂盒（申请号2019107271592）培养人脐带间充质干细胞，血清培养体系下细胞的融合度达到70-80％时更换为无血清培养基继续培养24-48h，收集培养上清液；/n（2）超滤法：/n1）收集细胞上清液分装至50ml离心管，1500rpm，10min；/n2）离心结束后，用20ml注射器吸取上清，用0.45μm 针头滤器过滤；/n3）取新的20ml注射器吸取过滤后的液体，用0.22μm 针头滤器过滤；/n4）过滤液加入超滤管内，3000g、15min；/n5）离心结束后，去除外管液体，并往内管添加过滤液，3000g，根据情况调整离心时间，单次不超过2H，直到理想浓度体积；/n6）收集内管的浓缩液并转移至新的15ml离心管，-80℃冻存备用；/n（3）超速离心法：/n1）收集浓缩液分装至50ml离心管；/n2）300g离心10min，去除完整细胞；/n3）2000g离心20min，进一步去除死细胞和杂质；/n4）10000g离心30min，去除细胞碎片；/n5）100000g离心70min，弃上清，沉淀用50ul PBS重悬；/n（4）外泌体质量控制/n电镜NanoSigh粒径分析显示，外泌体呈典型的杯状结构且粒径大小主要为100nm左右；将获得的外泌体蛋白抽提后进行Western Blotblot检测，其表达外泌体特异性蛋白Alix,CD63及CD9；内毒素检测阴性、真细菌、支原体、细胞内、外病毒因子检测、细胞因子残留量、BSA残留量和抗生素残留量合格。/n...

【技术特征摘要】
1.一种优化的从胎儿附属物（脐血、脐带、胎盘等）、毛囊、脂肪和牙髓、跟腱等中分离培养间充质干细胞（MSC）；3D培养间充质干细胞；从人外周血和脐血中分离制备DC、CIK、NK、TCM、TSCM，CAT-T、TCR-T、UCART、TIL、Treg等免疫细胞；从诱导多能干细胞和胚胎干细胞中分离制备外泌体的方法及应用：
（1）人体细胞来源外泌体的制备：
用本人发明的MSC培养试剂盒（申请号2019107271592）培养人脐带间充质干细胞，血清培养体系下细胞的融合度达到70-80％时更换为无血清培养基继续培养24-48h，收集培养上清液；
（2）超滤法：
1）收集细胞上清液分装至50ml离心管，1500rpm，10min；
2）离心结束后，用20ml注射器吸取上清，用0.45μm针头滤器过滤；
3）取新的20ml注射器吸取过滤后的液体，用0.22μm针头滤器过滤；
4）过滤液加入超滤管内，3000g、15min；
5）离心结束后，去除外管液体，并往内管添加过滤液，3000g，根据情况调整离心时间，单次不超过2H，直到理想浓度体积；
6）收集内管的浓缩液并转移至新的15ml离心管，-80℃冻存备用；
（3）超速离心法：
1）收集浓缩液分装至50ml离心管；
2）300g离心10min，去除完整细胞；
3）2000g离心20min，进一步去除死细胞和杂质；
4）10000g离心30min，去除细胞碎片；
5）100000g离心70min，弃上清，沉淀用50ulPBS重悬；
（4）外泌体质量控制
电镜NanoSigh粒径分析显示，外泌体呈典型的杯状结构且粒径大小主要为100nm左右；将获得的外泌体蛋白抽提后进行WesternBlotblot检测，其表达外泌体特异性蛋白Alix,CD63及CD9；内毒素检测阴性、真细菌、支原体、细胞内、外病毒因子检测、细胞因子残留量、BSA残留量和抗生素残留量合格。


2.应用权利要求1所述的人脐带MSC来源外泌体工业化生产和质量控制标准其特征在于，包括以下步骤：
脐带间充质干细胞的分离和培养方法：
MSC细胞培养添加剂MSC-配置，其中含有2-50ng/mLbFGF和2-50ng/mlEGF；
配置完全培养液的配制：MSC-中添加1/1000MSC-、2mMGlutaMAX™-I和10%Prime
FBS，取10ml包被150cm培养皿；
用尖头直剪将脐带剪成约2cm长度的小段，至少清洗3次，取最后一次清洗液20ml做菌检；
转移脐带组织至一新的培养皿中，将脐带一端沿静脉腔内剪个切口，用组织镊沿切口方向静脉血管边缘纵向撕开，用组织镊去除羊膜，小心地将1根静脉血管和2根动脉血管剖离，翻转脐带，撕去上皮，得到的华通氏胶用手术刀切成边长3-5mm之间的小块，将3-5mm之间的组织小块均匀的种植在150cm培养皿中，组织块之间的间距为1cm左右，放入培养箱中，48H后补液至30ml，至第七天静止不动；
第七天全量换液，经过11-15天的...

【专利技术属性】
技术研发人员：路春光，
申请(专利权)人：路春光，
类型：发明
国别省市：吉林;22