一种组合固定化β‑葡萄糖苷酶颗粒及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种组合固定化β‑葡萄糖苷酶颗粒及其制备方法，属于酶的固化领域。所述组合固定化β‑葡萄糖苷酶颗粒包括交联β‑葡萄糖苷酶聚集体核心和交联的高分子聚合物外壳；所述制备方法是通过交联‑包埋组合式固定化方法，首先在油包水乳化体系中制备了颗粒大小均匀的交联酶聚集体，然后对交联酶聚集体表面进行化学修饰引入碳碳双键基团，最后以乙烯基单体为原料，通过自由基原位聚合反应得到了该组合固定化β‑葡萄糖苷酶颗粒。本发明专利技术不仅操作简单、成本低廉、酶活回收率高、酶的稳定性强，而且方便回收重复利用，具有较广阔的应用前景。

A combination of immobilized beta glucosidase granule and preparation method thereof

The invention discloses a combination of immobilized beta glucosidase granule and preparation method thereof, and belongs to the field of enzyme curing. The combination of polymer shell immobilized beta glucosidase particles including beta glucosidase cross-linked aggregates and crosslinked core; the preparation method is embedded combined immobilization method by crosslinking package, first in the water in oil emulsion system was prepared by particle cross-linked enzyme aggregates size uniform. Then the cross-linked enzyme aggregates surface chemical modification into groups of carbon carbon double bond, finally using vinyl monomers as raw materials, through free radical polymerization in situ by the combination of immobilized beta glucosidase particles. The invention has the advantages of simple operation, low cost, high enzyme recovery rate, strong enzyme stability, convenient recovery and reuse, and wide application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒及其制备方法
本专利技术属于酶的固定化
，涉及一种组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒及其制备方法。
技术介绍
β-葡萄糖苷酶是广泛存在于自然界中的一类水解酶，它能够水解糖苷和寡糖中非还原性末端的β-糖苷残基从而释放葡萄糖和相应的配基。另外，β-葡萄糖苷酶可催化逆水解反应和转糖基反应，并合成相应的糖苷类化合物。随着糖苷类化合物在医药、食品、日用化工工业上有着重要的应用和经济价值，以及与化学法相比酶法合成糖苷具有高选择性、条件温和、反应过程简单以及环保等众多优点。因此，利用β-葡萄糖苷酶催化各类糖苷的合成和应用受到越来越多的关注。但是β-葡萄糖苷酶催化各类糖苷的合成反应大多数需要在非水相体系和较高温度环境中进行，然而，天然β-葡萄糖苷酶的稳定性较差、易失活，导致催化效率低，限制了其工业化应用，因而增强β-葡萄糖苷酶的稳定性是当前急需解决的问题。交联酶聚集体是近些年发展起来的一种无载体固定化酶技术。它的制备通常分为沉淀和交联两步，首先利用蛋白沉淀剂(如中性盐、水溶性有机溶剂、非离子型高聚物等)将溶解状态的酶进行物理沉淀得到酶沉淀聚集体，随后利用交联剂(例如戊二醛)与酶聚集体分子上的氨基发生反应，从而得到不溶性固定化酶颗粒。该方法获得的固定化酶制备过程简单、酶活保留率高、具有良好的稳定性和重复操作性，但是多次重复利用后聚集体表面结构容易被破坏而造成酶活损失，在非水相催化过程中酶的稳定性也不够。酶的包埋技术是借助化学或者物理的方法将酶固定在某种载体中的过程，载体的形成可以通过化学的方法(如交联、聚合)、物理的方法(物理的凝胶化)或这两种方法的结合。酶分子可以通过聚合物形成的凝胶载体而被包埋于其中，从而获得固定化酶。该方法制备过程简单、酶活保留率高，但是该方法固定的酶往往稳定性不够而且酶容易渗漏、重复回收利用率低。单一的固定化方法常常存在一些缺陷，如上述交联聚集体在非水相催化过程中稳定性不够，包埋法中易发生酶的泄漏和难以回收等。
技术实现思路
根据以上现有技术的不足，本专利技术所要解决的技术问题是提出一种组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒及其制备方法，通过交联-包埋组合式固定化方法制备出一种组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒。本专利技术首先在油包水乳化体系中制备出颗粒大小均匀的交联酶聚集体，然后对交联酶聚集体表面进行化学修饰引入碳碳双键基团，最后以乙烯基单体为原料，通过自由基原位聚合制备出一种回收率高且稳定性强的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：本专利技术提出一种组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒，包括核心与外壳，所述核心为交联β-葡萄糖苷酶聚集体，所述外壳为交联的高分子聚合物，所述核心位于外壳内部,所述核心与外壳之间通过化学键链接。本专利技术还提出一种组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒的制备方法，包括以下步骤：(1)将沉淀剂加入到蛋白浓度为10～50g/L的β-葡萄糖苷酶溶液中，振荡搅拌得到混合液；(2)向步骤(1)所得混合液中依次加入油相和乳化剂，磁力搅拌乳化1～3min，形成油包水体系后，在4～25℃下沉淀反应0.5～1h；(3)向步骤(2)所得产物中加入交联剂，磁力搅拌乳化1～3min，在4～25℃下交联反应1～3h，将反应得到的产物在5000r/min转速下离心10～15min，收集沉淀，用去离子水重复清洗2～3次，即得交联β-葡萄糖苷酶聚集体；(4)将步骤(3)得到的交联β-葡萄糖苷酶聚集体和能与β-葡萄糖苷酶表面氨基发生反应的且含有碳碳不饱和双键的酶修饰剂依次加入到pH值为4.0～7.0的缓冲溶液中，振荡搅拌，形成聚集体悬液，在4～25℃下反应0.5～6h后，置于截留分子量为12KDa的透析袋中透析12～24h；(5)向步骤(4)透析后的反应液中依次加入乙烯基单体和引发剂，在4～25℃下反应3～10h后，置于截留分子量为12KDa的透析袋中透析12～24h，在5000r/min转速下离心10～15min，收集沉淀，即得组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒，将该酶颗粒置于4℃冰箱中保存或冷冻干燥24h后置于4℃冰箱中保存。上述步骤(1)中沉淀剂为(NH4)2SO4、PEG400、PEG1000、PEG6000、PEG8000中的一种；所述(NH4)2SO4的加入量为30～80％(w/v)，所述PEG400、PEG1000、PEG6000、PEG8000的加入量分别为10～30％(w/v)。上述步骤(2)中油相为大豆油、橄榄油、花生油、液体石蜡、菜籽油、色拉油、蓖麻油、丁酸乙酯、辛癸酸甘油酯、月桂酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、油酸乙酯、油酸聚乙二醇甘油酯中的一种；所述步骤(2)中的油相与步骤(1)制备出的混合液的体积比为5～50:1。作为优选，上述油相与混合液的体积比为10:1。上述步骤(2)中的乳化剂为Tween60、Tween80、span40、span60、span80、AOT、SDS中的一种；所述乳化剂的加入量为0.2～3％(w/v)。上述步骤(3)中交联剂为戊二醛或葡聚糖聚醛；所述交联剂的加入量为0.5～5％(v/v)。上述步骤(4)中酶修饰剂为N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺与二甲基亚砜组成的混合物A、丙烯酰氯与二甲基亚砜组成的混合物B、甲基丙烯酸缩水甘油酯与二甲基亚砜组成的混合物C中的一种或几种，所述酶修饰剂的加入量为0.2～1％(w/v)。上述步骤(4)中缓冲溶液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液、磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲溶液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液中的一种。上述步骤(5)中乙烯基单体可以通过自由基聚合反应形成聚合物的单烯烃单体和多烯烃单体中的一种或多种，具体为丙烯酰胺、丙烯酸、丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟丙酯、丙烯酰化聚乙二醇、甲基丙烯酸、甲基炳烯酸甲酯、甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟丙酯、N-异丙基丙烯酰胺、N,N'-甲叉双丙烯酰胺、顺丁二烯中的一种或几种，所述乙烯基单体的加入量为2～5％(w/v)。上述步骤(5)中引发剂为a和b组成的混合物，所述a为过硫酸铵、过硫酸钾、过氧化氢、过氧化苯二甲酰中的一种或几种，所述b为N,N'-二甲基苯胺、氨水、N,N,N',N'-四甲基乙二胺、N-甲基吗啉和哌啶中的一种或几种。作为优选，上述步骤(5)中引发剂为1份过硫酸铵和1份N,N,N',N'-四甲基乙二胺组成的混合物，且加入量为0.5～1.5％(w/v)。本专利技术的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒的粒径大小为10～60μm。本专利技术有益效果是:本专利技术首先在油包水乳化体系中制备了颗粒大小均匀的交联酶聚集体，然后对交联酶聚集体表面进行化学修饰引入碳碳双键基团，最后以乙烯基单体为原料，通过自由基原位聚合得到了该组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒。该组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒为核壳结构，其核心为交联β-葡萄糖苷酶聚集体，外壳层为交联的高分子聚合物，核壳之间通过化学键链接，而且具有生物催化活性、稳定性高。本专利技术操作简单、成本低、酶活回收率高、酶颗粒大小均匀、酶的稳定性强，而且酶能够方便回收重复利用，具有广阔的应用前景。附图说明下面对本说明书附图所表达的内容及图中的标记作简要说明：图1是本专利技术的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒制备过程示意图；图2是本专利技术实施例一的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒重复利用稳定性变化图本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种组合固定化β‑葡萄糖苷酶颗粒，其特征在于：包括核心与外壳，所述核心为交联β‑葡萄糖苷酶聚集体，所述外壳为交联的高分子聚合物，所述核心位于外壳内部,所述核心与所述外壳之间通过化学键链接。

【技术特征摘要】
1.一种组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒，其特征在于：包括核心与外壳，所述核心为交联β-葡萄糖苷酶聚集体，所述外壳为交联的高分子聚合物，所述核心位于外壳内部,所述核心与所述外壳之间通过化学键链接。2.一种组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将沉淀剂加入到蛋白浓度为10～50g/L的β-葡萄糖苷酶溶液中，振荡搅拌得到混合液；(2)向步骤(1)所得混合液中依次加入油相和乳化剂，磁力搅拌乳化1～3min，形成油包水体系后，在4～25℃下沉淀反应0.5～1h；(3)向步骤(2)所得产物中加入交联剂，磁力搅拌乳化1～3min，在4～25℃下交联反应1～3h，将反应得到的产物离心，洗涤，过滤，即得交联β-葡萄糖苷酶聚集体；(4)将步骤(3)得到的交联β-葡萄糖苷酶聚集体和能与β-葡萄糖苷酶表面氨基发生反应的且含有碳碳不饱和双键的酶修饰剂依次加入到pH值为4.0～7.0的缓冲溶液中，振荡搅拌，形成聚集体悬液，在4～25℃下反应0.5～6h后，置于截留分子量为12KDa的透析袋中透析12～24h；(5)向步骤(4)透析后的反应液中依次加入乙烯基单体和引发剂，在4～25℃下反应3～10h后，置于截留分子量为12KDa的透析袋中透析12～24h，离心收集沉淀，冷冻干燥，即得组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒。3.根据权利要求2所述的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中沉淀剂为(NH4)2SO4、PEG400、PEG1000、PEG6000、PEG8000中的一种；所述(NH4)2SO4的加入量为30～80％(w/v)，所述PEG400、PEG1000、PEG6000、PEG8000的加入量分别为10～30％(w/v)。4.根据权利要求2所述的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中油相为大豆油、橄榄油、花生油、液体石蜡、菜籽油、色拉油、蓖麻油、丁酸乙酯、辛癸酸甘油酯、月桂酸乙酯、...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏胜华，钱伟，孟娜，马小淋，周清华，柯文君，郭良昊，徐书春，王韩杰，
申请(专利权)人：安徽工程大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34