一种酶固定化载体及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种酶固定化载体及其制备方法，属于材料科学与工程领域，包括PDEA‑b‑HEMA‑b‑GMA，其中GMA占温敏性单体的摩尔百分比范围为12‑92％，HEMA占温敏性单体的摩尔百分比范围为12‑84％，其LCST为33‑39℃，固定化PGA酶活力范围为660‑1030U/g、对应的游离酶量范围903‑1090U、酶活回收率大致范围为73‑95％，重复使用10次后，其酶活保留率为79％。

Enzyme immobilized carrier and preparation method thereof

The invention discloses an enzyme immobilized carrier and preparation method thereof, belonging to the field of materials science and engineering, including the PDEA B HEMA B GMA, which accounted for GMA molar percentage range of temperature sensitive monomer is 12 92%, HEMA accounted for Moore percentage range of temperature sensitive monomer is 12 84%, the LCST 33 39 C, PGA immobilized enzyme activity range free enzyme amount range of 660 1030U/g, corresponding to the 903 1090U, the enzyme recovery was 73 range 95%, after repeated 10 times, the activity retention rate was 79%.

【技术实现步骤摘要】
一种酶固定化载体及其制备方法
本专利技术属于材料科学与工程领域，涉及一种酶固定化载体及其制备方法。
技术介绍
固定化酶(Immobilizedenzyme)是20世纪60年代发展起来的一种新技术。所谓固定化酶，是指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。酶法生产6-氨基青霉素烷酸(6-Aminopenicillanicacid,6-APA)工艺的核心问题是高效固定化青霉素酰化酶(PenicillinGacylase,PGA)的制备技术，而载体材料的设计与制备是PGA固定化技术的关键所在。因此，本专利从载体微环境设计的角度出发，制备出一种酶活回收率高并具有适宜的低临界溶胶/凝胶相转变温度(Lowercriticalsolutiontemperature,LCST)的酶固定化载体。
技术实现思路
本专利技术的目的在于合成一类具有适宜低临界溶胶/凝胶相转变温度的温敏性嵌段共聚物载体，并通过对载体微环境的设计，制备出酶活回收率高的固定化酶。本专利技术将聚合物载体主链结构设计成可发生溶胶/凝胶相转变、具有适宜低临界溶解温度(LCST)的温敏性聚合物(Thermo-sensitivepolymer，TP)，实现在溶胶状态下进行PGA固定化和催化转化，在凝胶状态下从液体环境中回收再利用。载体是以可逆加成断裂转移自由基聚合(Reverseaddition-fragmentationtransfer,RAFT聚合)方法制备的嵌段聚合物。载体包含温敏性单体N,N-二乙基丙烯酰胺，微环境功能性单体甲基丙烯酸β-羟乙酯和靶点功能性丙烯酸类单体甲基丙烯酸缩水甘油酯三部分。载体微环境是由有利于PGA发挥催化活性的羟基功能基单体提供、固定化靶点由能与PGA在室温下与PGA上的胺基通过点击反应共价结合(不破坏PGA的高级结构，进而不会影响其催化活性)的环氧基提供，载体由能发生溶胶/凝胶相转变、具有适宜LCST的温敏性聚合物聚N,N-二乙基丙烯酰胺提供。基于上述设计制备的青霉素酰化酶固定化载体，可实现在溶胶状态下酶的固定化和催化转化，凝胶状态下的回收再利用。本专利技术合成的温敏性聚合物载体，其提供固定化靶点的单体和提供保持PGA活性的微环境的单体分别占温敏性单体的摩尔百分比范围为12-92％和12-84％，温敏性载体的LCST大致范围为33-39℃、固定化PGA酶活力范围为660-1030U/g(固定于载体上的单位质量的酶活力)、游离酶负载量范围903-1090U(被固定到载体上的游离酶量)、酶活回收率大致范围为73-95％。一种本专利技术酶固定化载体的制备方法，包括以下步骤：步骤1、温敏性三嵌段共聚物载体的制备1)温敏性聚合物大分子RAFT试剂的合成：以偶氮二异丁氰(Azodiisobutylcyanide,AIBN)和RAFT试剂三硫代十二烷酸-2-氰基异丙酯(Trithiododecanodi-2-cyanisopropyl,CPDTC)与温敏性单体N,N-二乙基丙烯酰胺(N,N-diethylacrylamide,DEA)的摩尔比为1:20:1000，温敏性单体与苊烯(Acenaphthylene,ACE)的质量比为1.2700:0.0035，称取一定质量的温敏性单体，以乙酸乙酯为溶剂，配制50％(质量百分比浓度)的溶液，通氮气30min后，在65℃油浴中搅拌反应一定时间，然后将粗产品溶沉三次(乙酸乙酯为溶剂，正葵烷为沉淀剂)得到一定分子量的大分子温敏性RAFT试剂；2)二嵌段共聚物的合成：保持AIBN、温敏性聚合物大分子RAFT试剂和提供微环境的功能单体甲基丙烯酸β-羟乙酯(Hydroxyethylmethacrylate，HEMA)间的摩尔比为1:20:1000，以N,N-二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide,DMF)为溶剂，配制浓度为50％(质量百分比浓度)的溶液，通氮气30min，65℃油浴中搅拌反应给定时间，溶沉三次(DMF为溶剂，乙醚为沉淀剂)，即得不同单体比例的二嵌段共聚物。3)三嵌段共聚物的合成：同2)的合成思路，将所得二嵌段RAFT试剂与甲基丙烯酸缩水甘油酯(Glycidylmethacrylate,GMA)共聚，即得不同单体比例的三嵌段共聚物(DMF为溶剂，乙醚为沉淀剂)。步骤2、固定化PGA称取一定量上述合成的三嵌段共聚物载体，加入到给定反应器中，再加入50倍嵌段共聚物质量的10％(原酶溶液按体积比稀释至10％)的游离PGA酶液，密封，在25℃条件下避光震荡24小时；分离游离酶残夜，固定化PGA用磷酸盐缓冲液冲洗，直到洗涤液中加入青霉素G，并用PDAB显色给定时间后，测得溶液的吸光度小于0.005为止；放入35℃真空烘箱干燥48小时，称重，得固定化PGA。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术合成了一种具有适宜低临界溶胶/凝胶相转变温度(LCST)的温敏性三嵌段共聚物载体，在低于LCST时，载体在舒展状态下使PGA发挥催化活性；而高于LCST时，载体收缩便于从液体环境中回收再利用。更重要的是，载体微环境由有利于PGA发挥催化活性的功能基单体(含有羟基的功能单体)构建，固定化靶点设计为能与PGA在室温下通过点击反应即可实现共价结合的含有环氧基的靶点单体。附图说明图1是6-APA标准曲线；图2是固定化PGA流程图。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术的技术方案作进一步详细地说明。1.嵌段共聚物1HNMR检测将嵌段共聚物样品各配制成浓度为10.00mg/mL的溶液，溶剂为氘代二甲亚砜(Dimethylsulfoxide-d,DMSO-d)，进行核磁共振氢谱(1HNMR)表征。嵌段共聚物温敏性检测将嵌段共聚物样品配制成浓度为0.01mg/mL的极稀水溶液，静态荧光光谱检测，表征其温敏性(LS-55型荧光光谱分析仪，美国Perkin-Elmer公司。检测条件为：激发波长290nm，扫描速度240nm/min，激发、发射狭缝均为10nm，扫描发射光波长范围330nm-430nm，在380nm处测荧光强度)。2.青霉素酰化酶的固定化及酶活力、酶负载量、酶活回收率的测定固定化如图2所示，称取一定量上述合成的三嵌段共聚物载体，加入到给定反应器中，再加入50倍嵌段共聚物质量的10％(原酶溶液按体积比稀释至10％)的游离PGA酶液，密封，在25℃条件下避光震荡24小时；分离游离酶残夜，固定化PGA用磷酸盐缓冲液冲洗，直到洗涤液中加入青霉素G，并用对-二甲氨基苯甲醛(p-dimethylaminobenzaldehyde,PDAB)显色给定时间后，测得溶液的吸光度小于0.005为止；放入35℃真空烘箱干燥48小时，称重，得固定化PGA。酶活力、酶负载量、酶活回收率的测定将一定量固定化PGA与10％(wt％)的50倍量的青霉素G钾反应5分钟，将反应液稀释一定倍数。取上清液0.5mL，加入3.5mLPDAB液显色3分钟后，通过PDAB显色法测定6-APA的含量，依式(1)、(2)、(3)计算酶活力、酶负载量、酶活回收率。AC＝av0-av(2)式中，ag代表固定化PGA酶活力(U/g)，C代表6-APA浓度(mM)，V代表6-APA体积(mL)，m代表PGA质量(g)，t代表固定化PGA与底物反应本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酶固定化载体，其特征在于，载体结构为PDEA‑b‑HEMA‑b‑GMA的三嵌段共聚物，其中GMA占温敏性单体的摩尔百分比范围为12‑92％，HEMA占温敏性单体的摩尔百分比范围为12‑84％，其LCST为33‑39℃，固定化PGA酶活力范围为660‑1030U/g、对应游离酶负载量范围903‑1090U、酶活回收率的范围为73‑95％，重复使用10次后，其酶活保留率为79％。

【技术特征摘要】
1.一种酶固定化载体，其特征在于，载体结构为PDEA-b-HEMA-b-GMA的三嵌段共聚物，其中GMA占温敏性单体的摩尔百分比范围为12-92％，HEMA占温敏性单体的摩尔百分比范围为12-84％，其LCST为33-39℃，固定化PGA酶活力范围为660-1030U/g、对应游离酶负载量范围903-1090U、酶活回收率的范围为73-95％，重复使用10次后，其酶活保留率为79％。2.根据权利要求1所述的酶固定化载体，其特征在于，PDEA-b-HEMA-b-GMA中各结构单元比例为100:47:24，其LCST为36℃，固定化青霉素酰化酶对应游离酶量为910U、酶活力820U/g、酶活回收率90％。3.一种权利要求1所述酶固定化载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、温敏性三嵌段共聚物载体的制备1)大分子RAFT试剂PDEA的合成：以AIBN与CPDTC与DEA摩尔比为1:20:1000，DEA与ACE质量比为1.2700:0.0035，称取一定质量的DEA，DEA质量分数为50％，乙酸乙酯为溶剂，装入试管中，超声1-2分钟，放入磁子，密封，通氮气，65℃油浴磁力搅拌反应一定时间，然后将粗产品溶沉三次，乙酸乙酯为溶剂，正葵烷为沉淀剂，得到一定分子量的大分子RAFT试剂PDEA；2)不同单体比例的二嵌段共聚物PDEA-b-PHEMA或PDEA-b-PGMA的合成：以AIBN与...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈振斌，王旭东，刘冬蕾，李轲，张霞云，李慧，
申请(专利权)人：兰州理工大学，
类型：发明
国别省市：甘肃,62