核酸和检测转基因水稻B1C893及其衍生系的方法以及试剂盒及其用途技术

本发明专利技术提供了转基因水稻B1C893的旁侧序列核酸，其包括右旁侧序列核酸和/或左旁侧序列核酸；所述右旁侧序列核酸的序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.1的片段；所述左旁侧序列核酸的序列为SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.9的片段。本发明专利技术还提供了与转基因水稻B1C893的旁侧序列核酸互补的核酸。本发明专利技术还提供了检测转基因水稻B1C893及其产品的方法、引物、探针、试剂盒、基因芯片和它们的用途。通过上述技术方案，本发明专利技术成功地实现了转基因水稻B1C893或者由B1C893通过各种育种方法产生的含有该核酸片段的水稻衍生系及其产品的检测。

Nucleic acids and methods for detecting transgenic rice B1C893 and its derived lines, kits and uses thereof

The present invention provides nucleic acid flanking sequences in transgenic rice B1C893, which includes the right flanking sequence of nucleic acid and / or left flanking sequence of nucleic acid sequence; the right flanking sequence for SEQ nucleic acid ID NO.1 or SEQ ID NO.1 fragment; sequence of the flanking sequence of nucleic acid is SEQ left NO.9 or ID SEQ ID NO.9 fragment. The invention also provides with transgenic rice B1C893 flanking sequence of nucleic acid complementary nucleic acid. The present invention also provides methods for detecting transgenic rice B1C893 and its products, primers, probes, kits, gene chips and their uses. Through the above technical scheme, the invention has successfully realized the detection of genetically modified rice B1C893 or rice derivative lines containing the nucleic acid fragments produced by B1C893 through various breeding methods.

【技术实现步骤摘要】
核酸和检测转基因水稻B1C893及其衍生系的方法以及试剂盒及其用途
本专利技术涉及农业生物
，具体地，涉及核酸、检测转基因水稻及其产品的方法、引物对、探针、试剂盒、基因芯片和它们的用途。
技术介绍
国际农业生物技术应用服务组织(InternationalServicefortheAcquisitionofAgri-biotechApplications,ISAAA)统计报告显示，2014年，全球转基因作物种植面积达到1.815亿公顷，比2013年的1.752亿公顷增长了3.6％；转基因作物在1995年至2014年间产生了多种重大效益:采用转基因技术使化学农药的使用率降低了37％，作物产量提高了22％，农民利润增加了68％(中国生物工程杂志，2015，35(1):1-14)。水稻(OryzasativaL.)作为世界上最重要的粮食作物之一，人们对其遗传转化和育种利用等方面进行了深入细致的研究。自第1批转基因水稻植株1988年问世以来，含有各种优良性状，如抗虫、抗除草剂、抗菌、抗病毒或营养改良，的转基因水稻相继研发成功。但各国对转基因水稻的商业化生产态度谨慎，仅有1999年美国批准了2个抗除草剂转基因水稻品种LL62和LL06的商业化种植(Environmentalassessmentforpetition98-329-01p.Determinationofnonregulatedstatusforricegeneticallyengineeredforglufosinateherbicidetolerance,1999)，2004年伊朗开始规模化种植抗虫转基因水稻(Globalstatusofcommercializedbiotech/GMcrops:2005.ISAAABriefNo34,2005)，2007年美国批准转重组人乳铁蛋白、溶菌酶、血清白蛋白3种基因的水稻在控制条件下种植(Findingofnosignificantimpactanddecisionnotice.Issuanceofpermitstogrowgeneticallyengineerriceproducingrecombinanthumanlactoferrin,lysozymeorserumalbumin,2007)。我国在水稻转基因研究领域取得了一系列重大成果，很多转基因水稻品种已被获准进行环境释放和生产性试验，2009年转Bt基因抗螟虫水稻“华恢1号”和“Bt汕优63”获得生产应用安全证书，标志着我国转基因水稻具备了商业化生产的基本条件；2014年底“华恢1号”和“Bt汕优63”的生产应用安全证书获得延期，有效期至2019年。为了平衡贸易利益、满足公众关切、控制潜在风险、加强工商监管，许多国家相继建立了转基因生物及其产品的安全评价和标识制度。我国现行对于农业转基因生物的管理依据的是国务院2001年5月23日颁布的《农业转基因生物安全管理条例》，以及农业部2002年1月5日发布的《农业转基因生物安全评价管理办法》、《农业转基因生物进口安全管理办法》和《农业转基因生物标识管理办法》3个配套规章。为了实现对转基因生物及其产品的标识管理，保障转基因产品的有效监管和转基因产业的健康发展，对转基因检测技术的准确度和灵敏度提出了严格要求。转基因植物中外源基因在染色体上插入位置的旁侧序列是转基因植物品系最重要的分子特征之一，是区别不同转化事件的唯一性标识，是建立转基因植物品系特异性检测方法的重要技术资料。如：王恒波等(转基因大豆GTS40-3-2转化事件特异性PCR检测.基因组学与应用生物学,2010,(06):1177-83)建立了抗草甘膦转基因大豆GTS40-3-2的品系特异性PCR检测方法。翟志芳等(转基因玉米LY038转化事件的特异性检测.农业生物技术学报,2011,(03):577-82)采用修饰接头连接PCR获得了转基因玉米LY038的外源基因与玉米基因组之间的5'端侧翼序列，据此建立了转基因玉米LY038转化事件特异性定性检测方法。就水稻而言，谢家建等建立了转Xa21基因抗病水稻抗优97的特异性检测方法(转Xa21基因水稻抗优97特异性检测方法的建立.中国植物病理学会2006年学术年会,中国湖南长沙)，中国水稻所的王渭霞等扩增出了转基因水稻科丰6号的旁侧序列，专利技术了基于这一旁侧序列的转化事件特异性检测方法并申请了专利(CN101824411A)。苏长青等测定了的转Cry1Ab/Cry1Ac融合基因水稻品系“Bt汕优63”的外源插入DNA全序列，建立了实时荧光定量PCR方法(转基因水稻Bt汕优63的整合结构和品系特异性定量PCR方法.农业生物技术学报,2011,19(3),434-441)。2013年，董立明等获得了转Bt-Pta-Bar基因玉米JL937的插入位点侧翼序列，并建立了特异性检测方法(转Bt-pta-bar基因玉米侧翼序列分析及特异性检测方法研究.玉米科学,2013,1(3):30-34)；蒋利平等获得了抗虫抗除草剂转基因水稻B2A68的侧翼序列，建立了特异性检测方法并申请了专利(转基因水稻B2A68事件特异性检测方法的建立.杂交水稻,2013,28(5):60-67.专利申请CN201310068126.8)。利用密码子优化的Cry1Ca#基因和Bar基因共同转化水稻恢复系R893，可获得抗除草剂、抗虫的转基因水稻。既抗除草剂、又抗螟虫的转基因水稻不仅能减少农药的使用，并且能方便除草，在生产上具有广泛应用前景。本专利技术的专利技术人通过利用密码子优化的Cry1Ca#基因和Bar基因转化水稻，获得了一个转基因水稻新品系B1C893(抗虫抗除草剂转基因水稻B1C893的获得与鉴定.杂交水稻，2014，29(1):67-71.专利申请CN201310305677.1)。由于外源基因的插入具有随机性，转基因水稻新品系B1C893的外源基因在基因组中插入位置并不清楚，因此难以实现对转基因水稻B1C893及其衍生品系的特异性检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是实现对转基因水稻B1C893及其衍生品系的特异性检测。转基因水稻新品系B1C893已经在文献中公开(抗虫抗除草剂转基因水稻B1C893的获得与鉴定.杂交水稻,2014，29(1):67-71)，可以通过向中国科学院亚热带农业生态研究所来函索取的方式获得。水稻基因组大小一般认为有4.3亿bp。由于基因转化过程中外源基因的插入具有随机性，插入到水稻基因组某个固定位置的几率理论上有4.3亿分之一。但是，基因转化是一个不可以人为控制的复杂生物学过程，具有很大的技术难度，水稻转基因育种中获得的转化事件数量是有限的(一般不超过50个)，不可能重复出现一个极小概率的事件，外源基因实际上没有机会插入到水稻基因组的同一位置，每个独立的转化事件都具有唯一性，随之而来的外源基因序列与水稻基因组序列拼接而成的旁侧序列也具有唯一性。因此，旁侧序列的核酸是一种全新的核酸分子。本专利技术的专利技术人率先得到了转基因水稻B1C893外源基因旁侧序列的具体序列信息，由此建立的检测方法是检测转基因水稻品系B1C893及含有该核酸衍生系的水稻及其产品的特异性方法。一方面，本专利技术提供了本文档来自技高网...

【技术保护点】
核酸，该核酸包括右旁侧序列核酸和/或左旁侧序列核酸；其特征在于，所述右旁侧序列核酸的序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.1的片段，其中，所述SEQ ID NO.1的片段至少含有SEQ ID NO.1的第814‑825位的序列；优选所述SEQ ID NO.1的片段至少含有SEQ ID NO.1的第799‑840位的序列，更优选所述SEQ ID NO.1的片段至少含有SEQ ID NO.1的第789‑850位序列，更进一步优选所述SEQ ID NO.1的片段至少含有SEQ ID NO.1的第779‑860位的序列；所述左旁侧序列核酸的序列为SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.9的片段，其中，所述SEQ ID NO.9的片段至少含有SEQ ID NO.9的第1877‑1888位序列；优选所述SEQ ID NO.9的片段至少含有SEQ ID NO.9的第1862‑1903位的序列，更优选所述SEQ ID NO.9的片段至少包括SEQ ID NO.9的第1852‑1913位的序列，更进一步优选至少包括SEQ ID NO.9的第1842‑1923位的序列。

【技术特征摘要】
1.核酸，该核酸包括右旁侧序列核酸和/或左旁侧序列核酸；其特征在于，所述右旁侧序列核酸的序列为SEQIDNO.1或SEQIDNO.1的片段，其中，所述SEQIDNO.1的片段至少含有SEQIDNO.1的第814-825位的序列；优选所述SEQIDNO.1的片段至少含有SEQIDNO.1的第799-840位的序列，更优选所述SEQIDNO.1的片段至少含有SEQIDNO.1的第789-850位序列，更进一步优选所述SEQIDNO.1的片段至少含有SEQIDNO.1的第779-860位的序列；所述左旁侧序列核酸的序列为SEQIDNO.9或SEQIDNO.9的片段，其中，所述SEQIDNO.9的片段至少含有SEQIDNO.9的第1877-1888位序列；优选所述SEQIDNO.9的片段至少含有SEQIDNO.9的第1862-1903位的序列，更优选所述SEQIDNO.9的片段至少包括SEQIDNO.9的第1852-1913位的序列，更进一步优选至少包括SEQIDNO.9的第1842-1923位的序列。2.核酸，其特征在于，该核酸的序列与权利要求1所述的核酸的序列互补。3.引物，该引物为用作判断转基因水稻B1C893转化事件及含有该转基因事件产品的特异性引物，其特征在于，该引物包括针对权利要求1或2所述的核酸设计的特异性引物。4.根据权利要求3所述的引物，其中，所述引物包括针对SEQIDNo.1的第1-819位的区域设计的右侧上游引物和针对SEQIDNo.1的第820-2952位的区域设计的右侧下游引物；优选地，所述右侧上游引物如SEQIDNO.12所示，所述右侧下游引物如SEQIDNO.13所示。5.根据权利要求3所述的引物，其中，所述特异性核酸引物包括针对SEQIDNo.9的第1-1882位的区域设计的左侧上游引物和针对SEQIDNo.9的第1883-2590位的区域设计的左侧下游引物；优选地，所述左侧上游引物如SEQIDNO.14所示，所述左侧下游引物如SEQIDNO.15所示。6.检测转基因水稻和转基因水稻产品的方法，该水稻样品为或来源为转基因水稻B1C893或者含有权利要求1或2所述的核酸的转基因水稻B1C893的衍生系，其特征在于，该方法包括：(1)使用权利要求3-5中任意一项所述的引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖国樱，魏岁军，邓力华，
申请(专利权)人：中国科学院亚热带农业生态研究所，
类型：发明
国别省市：湖南,43