一种新型酵母诱导型启动子及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种新型酵母诱导型启动子及其应用，属于分子生物学技术领域。其技术方案为：其为序列表中序列1所示的DNA序列；该启动子长度为673bp。本发明专利技术的有益效果为：本发明专利技术的酵母诱导型启动子DDI2，其可被氰胺高效诱导，启动子强度与已知诱导型强启动子GAL1相近，比组成型启动子ADH1强，且诱导时不用更换培养基，可通过诱导时间和诱导剂的量控制基因的表达量，与常用的GAL1启动子相比在时间成本和价格成本上更具优势。流式细胞仪检测结果显示DDI2启动子强度大于ADH1启动子,与GAL1启动子强度相近，且所需诱导时间少于GAL1启动子，不用更换培养基。通过Western和流式细胞仪检测结果，可以得到DDI2启动子强度在诱导物浓度为5‑8mM时达到最大。

A novel yeast inducible promoter and its application

The invention provides a novel yeast inducible promoter and an application thereof, belonging to the technical field of molecular biology. The technical proposal is that it is a DNA sequence shown in sequence table 1, and the promoter length is 673bp. The invention has the advantages that the invention of the yeast inducible promoter DDI2, which can be efficiently induced by melamine promoter strength, with known inducible promoter GAL1 than similar constitutive promoter ADH1, and induced without changing the culture medium, the induction time and inducer quantity control the amount of gene expression, and the commonly used GAL1 promoter in time cost and price cost advantage. Flow cytometry showed that the DDI2 promoter was stronger than the ADH1 promoter and was similar in strength to the GAL1 promoter, and the induction time was less than that of the GAL1 promoter, without replacing the medium. Through Western and the result of the flow cytometer, can get DDI2 promoter strength in inducer concentration was 5 reached the maximum at 8mM.

【技术实现步骤摘要】
一种新型酵母诱导型启动子及其应用
本专利技术涉及分子生物学
，尤其涉及一种新型酵母诱导型启动子及其应用。
技术介绍
细胞中基因的表达受到多种因素的影响，如顺式作用元件、反式作用因子等，在细胞生长阶段，与RNA聚合酶相联系的转录因子的表达水平及其它基因水平的调节有关。其中，启动子是启动特定基因转录的DNA序列，是基因表达调控的重要顺式元件,也是基因工程表达载体的一个重要组成部分。启动子功能的强弱对于目的基因的表达至关重要。启动子含有特异性DNA序列，例如给RNA聚合酶和招募RNA聚合酶的转录因子提供可靠的初始结合位点。通常增高一个基因的表达量，会给它添加一个组成型的强启动子或诱导上调的启动子，降低或关闭一个基因的表达，会给添加一个弱启动子或诱导下调的启动子。通过更换启动子来调节基因的表达在改变酵母的代谢途径中得到了广泛应用。酵母启动子有以下几种类型：(1)组成型：是指能够使基因在所有组织中都能启动表达的启动子，其不受外界条件的影响。这类启动子不需要诱导物或抑制物，所启动基因的表达具持续性。(2)诱导型：是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下，该种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平。诱导型启动子能同时控制基因的表达量和基因的表达时间。在酿酒酵母中，一系列多种多样的内源诱导型启动子和改造过的诱导型启动子已被成功应用于基因表达的调控。其中在酿酒酵母中，最为严谨的调控性启动子是来自半乳糖诱导的基因GAL1、GAL7、GAL10。上述两种酵母启动子中组成型启动子不表现时空特异性，不受诱导物的调控，不能随时调控基因的表达；诱导型启动子在酵母中最常用到的是PGAL1,它可以被半乳糖诱导，但是在培养中需要先进行棉子糖饥饿处理后半乳糖诱导，更换培养基耗时耗力。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新型酵母诱导型启动子及其应用。为实现上述专利技术目的，本专利技术是通过如下措施实现的：一种新型酵母诱导型启动子，为序列表中序列1所示的DNA序列；该启动子长度为673bp。其中，制备过程为：(一)酿酒酵母的基因组DNA提取：①、收集5ml酵母细胞，离心(16000g,15s)后弃上清，加230ulDNA裂解液重悬菌体；②、加入0.4g小玻璃珠，和200ul苯酚/氯仿/异戊醇的混合溶液，涡旋3min；其中，苯酚、氯仿和异戊醇的质量份数比为25:24:1；③、离心(16000g,5min)后将水层转移到一个新的EP管中；④、加600ul冰乙醇洗剂DNA,然后将EP管放在-20℃中30min；⑤、在4℃下离心收集DNA(16000g,15min)，弃乙醇，在空气中干燥3min；⑥、用200ulTE重悬DNA,加5ulRNA酶后37℃孵育10min；⑦、加5MNaCl8ul和两倍体积的冰乙醇，在-20℃放置30min；离心(16000g,15min)后弃乙醇，放在空气中干燥；⑧、用水/TE重悬DNA,得到酵母基因组DNA；(二)用高保真Phusion酶PCR扩增得到DDI2启动子：PCR体系的总体积50μl，其中Phusion0.5μl、PhusionBuffer10μl、dNTPMix2μl、模板100ng、上游引物(浓度10μM)1μl、下游引物(浓度10μM)1μl、H2O补足到50μl；prc反应条件为：98℃、1min条件下进行预变，然后98℃、10s，55℃、30s，72℃、40s，如此进行30个循环，然后在72℃、10min进行扩增，扩增得到DDI2启动子。其中，所述引物对的序列如下：U1:5’-TCTAAGATAAAACACAGATCGAC-3’U2:5’-GATTGATTCTTTTGAAGAGAAGC-3’。另外，本专利技术还提供了所述的酵母诱导型启动子在调控酵母基因表达中的应用：所述酵母为酿酒酵母。其中，诱导物为氰胺。其中，所述氰胺的浓度为5-8mM。本专利技术的有益效果为：本专利技术的新型的酵母诱导型启动子DDI2，其可被氰胺高效诱导，启动子强度与已知诱导型强启动子GAL1相近，比组成型启动子ADH1强，且不用更换培养基，可通过诱导时间和诱导剂的量控制基因的表达量，与常用的GAL1启动子相比在时间成本和价格成本上更具优势。本专利将DDI2启动子与传统的酵母组成型启动子ADH1及诱导型启动子GAL1相比较，首先构建三种“启动子-sfGFP”的单拷贝质粒并转入酵母W303中，然后用荧光共聚焦显微镜拍照，并用流式细胞仪(FCM)检测荧光表达。流式细胞仪检测结果显示DDI2启动子强度大于ADH1启动子,与GAL1启动子强度相近，且所需诱导时间少于GAL1启动子，不用更换培养基；并且DDI2启动子强度在诱导物氰胺浓度为5-8mM下强度最大。附图说明图1为构建YCplac111-PADH1-sfGFP的质粒图谱。图2为构建YCplac111-PGAL1-sfGFP的质粒图谱。图3为构建YCplac111-PDDI2-sfGFP的质粒图谱。图4为三种启动子调控sfGFP表达在共聚焦显微镜下的结果。图5为两种启动子在不同时间下调控荧光的表达强度。图6为DDI2启动子在不同浓度氰胺诱导下的荧光强度。图7为不同浓度氰胺诱导下DDI2调控sfGFP在翻译水平的表达情况。序列1为DDI2启动子；序列2为ADH1启动子；序列3为GAL1启动子。具体实施方式为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。本专利技术是通过如下措施实现的：一种新型酵母诱导型启动子，为序列表中序列1所示的DNA序列；该启动子长度为673bp。其中，制备过程为：(一)酿酒酵母的基因组DNA提取：①、收集5ml酵母细胞，离心(16000g,15s)后弃上清，加230ulDNA裂解液重悬菌体；②、加入0.4g小玻璃珠，和200ul苯酚/氯仿/异戊醇的混合溶液，涡旋3min；其中，苯酚、氯仿和异戊醇的质量份数比为25:24:1；③、离心(16000g,5min)后将水层转移到一个新的EP管中；④、加600ul冰乙醇洗剂DNA,然后将EP管放在-20℃中30min；⑤、在4℃下离心收集DNA(16000g,15min)，弃乙醇，在空气中干燥3min；⑥、用200ulTE重悬DNA,加5ulRNA酶后37℃孵育10min；⑦、加5MNaCl8ul和两倍体积的冰乙醇，在-20℃放置30min；离心(16000g,15min)后弃乙醇，放在空气中干燥；⑧、用水/TE重悬DNA,得到酵母基因组DNA；(二)用高保真Phusion酶PCR扩增得到DDI2启动子：PCR体系的总体积50μl，其中Phusion0.5μl、PhusionBuffer10μl、dNTPMix2μl、模板100ng、上游引物(浓度10μM)1μl、下游引物(浓度10μM)1μl、H2O补足到50μl；prc反应条件为：98℃、1min条件下进行预变，然后98℃、10s，55℃、30s，72℃、40s，如此进行30个循环，然后在72℃、10min进行扩增，扩增得到DDI2启动子。其中，所述引物对的序列如下：U1:5’-TCTAAGATAAAACACAGATCGAC-3’U2:5’-GATTGATTCTTTTGAAGAGAAGC-3’。另外，本专利技术还提供了所述的酵母诱导型启动子在调控酵母基因表本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酵母诱导型启动子，其特征在于，为序列表中序列1所示的DNA序列；该启动子长度为673bp。

【技术特征摘要】
1.一种酵母诱导型启动子，其特征在于，为序列表中序列1所示的DNA序列；该启动子长度为673bp。2.根据权利要求1所述的酵母诱导型启动子，其特征在于，制备过程为：(一)酿酒酵母的基因组DNA提取：①、收集5ml酵母细胞，离心(16000g,15s)后弃上清，加230ulDNA裂解液重悬菌体；②、加入0.4g小玻璃珠，和200ul苯酚/氯仿/异戊醇的混合溶液，涡旋3min；其中，苯酚、氯仿和异戊醇的质量份数比为25:24:1；③、离心(16000g,5min)后将水层转移到一个新的EP管中；④、加600ul冰乙醇洗剂DNA,然后将EP管放在-20℃中30min；⑤、在4℃下离心收集DNA(16000g,15min)，弃乙醇，在空气中干燥3min；⑥、用200ulTE重悬DNA,加5ulRNA酶后37℃孵育10min；⑦、加5MNaCl8ul和两倍体积的冰乙醇，在-20℃放置30min；离心(16000g,15min)后弃乙醇，放在空气中干燥；⑧、用水/TE重悬DNA,得到酵母基...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅钰，张恺宁，郝智慧，王苹苹，
申请(专利权)人：青岛百慧智业生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37