一种定量高通量测序文库的制备方法及其配套试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种定量高通量测序文库的制备方法及其配套试剂盒，具体地，本发明专利技术提供了一种衔接子，所述衔接子具有式I或II所示的结构：各式中，S1为任选地引导部(N)m，N为A、T、G、C中任一碱基，m为1‑150的正整数；pS1为磷酸化的S1；S2为茎部1，具有SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列；S3为环部，其中含有至少一个碱基U；S4为茎部2，具有SEQ ID NO.:2所示的核苷酸序列；S2与S4完全互补或部分互补；S5为无或与引导部S1互补的延伸部；S6为无或含有至少一个碱基T的结合部；若S5为无，则S6为无；“─”为化学键。5'‑S1─S2─S3─S4─S5─S6‑3'   (I)5'‑pS1─S2─S3─S4─S5─S6‑3'   (II)。

【技术实现步骤摘要】
一种定量高通量测序文库的制备方法及其配套试剂盒
本专利技术涉及生物
，更具体地，涉及一种精确定量制备高通量测序文库的方法及其配套试剂盒。
技术介绍
随着高通量测序技术的普及，针对各种不同来源样品的高通量测序文库制备方法及商业试剂盒也得到大量应用。市场上主流的高通量文库制备试剂盒诸如Illumina公司的Truseq系列DNA/RNA文库制备试剂盒，KAPA公司的Hyper系列建库试剂盒，NEB公司用于二代测序的NEBNextDNA/RNA文库制备试剂等，这些种类繁多、功能各异的试剂盒能应对不同测序平台、不同样本来源等各种需求，最大程度地满足科研和临床等实际应用。不过，目前还没有一种完全定量化的文库制备方法，无法满足精准医学和定量生物学的实际需要。因此，本领域尚缺乏一种专门针对精确定量需求的高通量测序文库制备方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种精确定量化的针对DNA样品的高通量测序文库制备方法。本专利技术的第一方面提供了一种衔接子，所述衔接子具有式I或II所示的结构：5'-S1─S2─S3─S4─S5─S6-3'(I)5'-pS1─S2─S3─S4─S5─S6-3'(II)各式中，S1为任选地引导部(N)m，N为A、T、G、C中任一碱基，m为1-150的正整数；pS1为磷酸化的S1；S2为茎部1，具有SEQIDNO.:1所示的核苷酸序列；S3为环部，其中含有至少一个碱基U；S4为茎部2，具有SEQIDNO.:2所示的核苷酸序列；S2与S4完全互补或部分互补；S5为无或与引导部S1互补的延伸部；S6为无或含有至少一个碱基T的结合部；若S5为无，则S6为无；“─”为化学键。在另一优选例中，所述的衔接子为线性结构、或茎环结构。在另一优选例中，所述的衔接子具有式III或IV所示结构：在另一优选例中，m为1-100，更佳地1-50，最佳地5-20的任一正整数。在另一优选例中，m为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。在另一优选例中，所述环部S3具有SEQIDNO.:3所示的核苷酸序列。在另一优选例中，所述S6含有1个碱基T。在另一优选例中，所述衔接子的S2具有SEQIDNO.:1所示的核苷酸序列；S3具有SEQIDNO.:3所示的核苷酸序列；S4具有SEQIDNO.:2所示的核苷酸序列。在另一优选例中，S2与S4是完全互补的，或除了未互补的1或2个碱基之外均为是互补的。本专利技术的第二方面提供了一种基于核酸样品构建测序文库的方法，包括步骤：(a)提供一用于构建测序文库的核酸样品；(b)对所述的核酸样品进行末端修复反应，获得末端经修复的核酸样品；(c)对所述的末端经修复的核酸样品进行3'末端加dA尾反应，获得经加尾的核酸样品；(d)将所述经加尾的核酸样品与权利要求1-5中任一所述的衔接子混合，并进行连接反应，从而形成含“衔接子-核酸-衔接子”复合物的第一混合物；(e)将步骤(d)中获得的“衔接子-核酸-衔接子”复合物与USER酶混合，使得衔接子中的U被降解，形成含末端分叉不互补的“衔接子-核酸-衔接子”复合物的第二混合物；(f)将步骤(e)中获得的含所述复合物的第二混合物与片段分选磁珠混合，使得所述片段分选磁珠吸附多余的衔接子，并将所述被吸附的衔接子去除，获得第三混合物；(g)以步骤(f)获得的所述复合物为模板，用特异性结合于衔接子的第一引物和特异性结合于衔接子的第二引物进行PCR反应，获得扩增产物；(h)以将步骤(g)中获得的扩增产物为原料，制得测序文库。在另一优选例中，在步骤(h)中，还包括对所述扩增产物进行纯化的步骤。在另一优选例中，所述的纯化包括用片段分选磁珠去除多余的引物。在另一优选例中，所述步骤(c)和(d)之间还包括步骤：(i)对式I所示的衔接子进行5'末端磷酸化反应，使其形成式II所示结构；或对式III所示的衔接子进行5'末端磷酸化反应，使其形成式IV所示结构。在另一优选例中，所述步骤(c)和(d)之间还包括步骤：(j)对式I或所示的衔接子进行退火，使其形成式III所示结构；或对式II或所示的衔接子进行退火，使其形成式IV所示结构。在另一优选例中，所述步骤(c)和(d)之间还包括步骤：(k)当S5为无时，对式I-IV任一所示的衔接子进行链延伸反应，补齐简并碱基部分形成互补双链。在另一优选例中，所述步骤(c)和(d)之间还包括步骤：(l)当S5不为无时，对I-IV任一所示的衔接子进行3'末端加dT尾反应；或当S5为无时，对步骤(k)中获得的衔接子进行3'末端加dT尾反应。在另一优选例中，所述片段分选磁珠选自下组：AMPureXP磁珠、HieffNGSDNA分选磁珠、Imag片段分选磁珠。在另一优选例中，所述测序文库可用于Illunima高通量测序平台直接测序。在另一优选例中，所述测序文库可用于精确定量。在另一优选例中，所述步骤(a)中核酸样品总量为500pg～1μg。本专利技术的第三方面提供了一种基于核酸样品构建测序文库的试剂盒，所述试剂盒包括：一末端修复/加dA尾复合酶及其缓冲液；一T4DNA连接酶；一衔接子，所述的衔接子如本专利技术的第一方面中任一所述；和说明书，所述的说明书记载了使用方法。在另一优选例中，所述试剂盒还包括：特异性结合于衔接子的第一引物和第二引物。在另一优选例中，所述第二引物带有测序标记(barcode)。在另一优选例中，所述第一引物为通用引物P5，其序列如SEQIDNO.:5所示。在另一优选例中，所述第二引物为特异引物P7。在另一优选例中，所述第二引物为特异引物P7，其序列如SEQIDNO.:6所示。在另一优选例中，所述试剂盒还包括酶缓冲液。在另一优选例中，所述试剂盒还包括PCR反应预混液。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1是衔接子制备过程的示意图。具体实施方式本专利技术人经过长期而深入的研究，意外开发出了一种具有式I-IV中任一所示的结构的衔接子，其能够用于制备DNA高通量测序文库；以及使用该衔接子的构建DNA高通量测序文库的方法和相应试剂盒，使用所述方法，能够制备精确定量的高通量测序文库。基于上述发现，完成了本专利技术。针对DNA样品制备精确定量的高通量测序文库方法本专利技术提供了一种基于核酸样品制备定量化高通量测序文库的方法，所述的方法包括步骤：(a)提供一用于制备测序文库的核酸样品，总量为500pg～1μg(或1-200ng，或0.5-10ng)；(b)对所述的核酸样品进行末端修复反应；(c)对所述的核酸样品进行3'末端加dA尾反应；(d)提供一用于制备衔接子(adaptor)的单链核酸样品，序列为附件所示，其5'末端包含有5～20个简并碱基，3'末端倒数第34个碱基为U；(e)对上述单链核酸样品进行5'末端磷酸化反应；(f)对上一步获得的核酸样品进行退火，使其形成茎环结构；(g)对上一步获得的核酸样品进行链延伸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种衔接子，其特征在于，所述衔接子具有式I或II所示的结构：5'‑S1─S2─S3─S4─S5─S6‑3'        (I)5'‑pS1─S2─S3─S4─S5─S6‑3'       (II)各式中，S1为任选地引导部(N)m，N为A、T、G、C中任一碱基，m为1‑150的正整数；pS1为磷酸化的S1；S2为茎部1，具有SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列；S3为环部，其中含有至少一个碱基U；S4为茎部2，具有SEQ ID NO.:2所示的核苷酸序列；S2与S4完全互补或部分互补；S5为无或与引导部S1互补的延伸部；S6为无或含有至少一个碱基T的结合部；若S5为无，则S6为无；“─”为化学键。

【技术特征摘要】
1.一种衔接子，其特征在于，所述衔接子具有式I或II所示的结构：5'-S1─S2─S3─S4─S5─S6-3'(I)5'-pS1─S2─S3─S4─S5─S6-3'(II)各式中，S1为任选地引导部(N)m，N为A、T、G、C中任一碱基，m为1-150的正整数；pS1为磷酸化的S1；S2为茎部1，具有SEQIDNO.:1所示的核苷酸序列；S3为环部，其中含有至少一个碱基U；S4为茎部2，具有SEQIDNO.:2所示的核苷酸序列；S2与S4完全互补或部分互补；S5为无或与引导部S1互补的延伸部；S6为无或含有至少一个碱基T的结合部；若S5为无，则S6为无；“─”为化学键。2.如权利要求1所述的衔接子，其特征在于，m为1-100，更佳地1-50，最佳地5-20的任一正整数。3.如权利要求1所述的衔接子，其特征在于，所述环部S3具有SEQIDNO.:3所示的核苷酸序列。4.如权利要求1所述的衔接子，其特征在于，所述S6含有1个碱基T。5.如权利要求1所述的衔接子，其特征在于，所述衔接子的S2具有SEQIDNO.:1所示的核苷酸序列；S3具有SEQIDNO.:3所示的核苷酸序列；S4具有SEQIDNO.:2所示的核苷酸序列。6.一种基于核酸样品构建测序文库的方法，其特征在于，包括步骤：(a)提供一用于构建测序文库的核酸样品；(b)对所述的核酸样品进行末端修复反应，获得末端经修复的核酸样品；...

【专利技术属性】
技术研发人员：李鑫辉，王琪，邵志峰，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海,31