基于RPA‑IAC技术筛查大豆花叶病毒的方法、RPA‑IAC引物及试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种引物对和内标扩增序列，所述引物对包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所述内标扩增序列包含SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。本发明专利技术还提供了所述的引物对及内标扩增序列在制备筛查或辅助筛查大豆花叶病毒的产品中的应用；以及基于RPA‑IAC技术的筛查大豆花叶病毒的方法。经实验证明，本发明专利技术的基于RPA‑IAC引物并配合内标扩增序列建立的大豆花叶病毒RPA‑IAC筛查方法特异性好、灵敏度高、筛查时间短、质控效果佳、不需要特殊的仪器且适用范围广，对进出口相关植物及产品筛查具有指导意义。

RPA method, IAC screening of soybean mosaic virus RPA primer and kit based on IAC

The present invention provides a primer and internal standard amplified sequences, nucleotide sequences of the primers are shown to contain SEQ ID NO:1 nucleotide sequence and SEQ ID NO:2 shows the amplified sequence contains a nucleotide sequence of the SEQ ID NO:3 shown in the internal standard. The invention also provides a primer on the internal standard and application of amplified sequences in the preparation of screening or auxiliary screening of soybean mosaic virus in the product; and the RPA method based on IAC technology screening of soybean mosaic virus. The experiment proved that the amplified sequence of soybean mosaic virus RPA IAC screening method with good specificity, high sensitivity, short time and quality control screening effect, does not require special equipment and is suitable for a wide range of RPA IAC primers and with internal standard based on the invention, has a guiding significance for the import and export of related products and screening plant.

【技术实现步骤摘要】
基于RPA-IAC技术筛查大豆花叶病毒的方法、RPA-IAC引物及试剂盒
本专利技术涉及生物筛查领域，特别涉及筛查大豆花叶病毒的RPA-IAC方法、引物及试剂盒。
技术介绍
大豆花叶病毒(Soybeanmosaicvirus,SMV)为马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)成员。SMV初侵来源主要是带毒种子，病毒会存在于种胚与子叶中(花粉携毒)，毒力能保持两年，甚至更久，带毒种子发育成幼苗后，叶、茎都可能带有病毒并表现出相应症状。由于SMV很易接触传染，所以无论发病与否，都可能成为田间再侵染的毒源。携毒蚜虫也是SMV自然传播的另一个重要因素，能造成病毒再次传播，具有非持久性特征。SMV是一种在世界性广泛分布并极具破坏性的一种的病毒。受害植株豆荚数量减少，百粒重降低，褐斑粒增多。常年减产5％－7％，重病年减产10％－25％，个别年份或少数地区可达95％，甚至绝收；并且病株豆粒蛋白质含量及油含量减少，影响种子商品价值，每年都会给很多国家带来巨大的农业经济损失。由于该病害在世界范围内广泛分布并普遍发生，导致大豆严重减产和种质衰退，所以建立SMV病毒病害的快速准确的筛查方法对于该病害的准确诊断及把握该病害的流行规律和提出有效防治措施非常重要。目前大豆花叶病毒病的检测主要包括生物学鉴定、电镜鉴定和逆转录聚合酶链式扩增反应(RT-PCR)。生物学鉴定周期长，电镜鉴定对样本的制备比较繁琐且需要昂贵的电子显微镜，而RT-PCR技术需要热循环设备。RPA(Recombinasepolymeraseamplifcation)是一项新型的等温扩增技术，其主要原理为利用重组酶和引物在模板DNA上搜索到与之完全互补配对的序列时，在单链DNA结合蛋白的帮组下使模板DNA解链，引物与模板DNA开始配对，并在DNA聚合酶的作用下复制延伸。该方法仅需1对引物即可完成扩增，不需要复杂的引物设计过程；只需要37℃下恒温反应，不需要特殊的热循环设备；反应时间短；扩增产物有特定大小的条带，结果易于判断。而RPA与扩增内标(InternalAmplificationControl,IAC)的结合使用则会有效控制假阴性的出现，大大提高了检测的准确性，避免了漏检，能够更有效的筛查防控该病毒的发生危害。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种灵敏、准确、简便和快速的基于RPA-IAC技术的筛查大豆花叶病毒的方法，本专利技术还提供了用于该方法的特异性好、灵敏度高、筛查时间短、质控效果佳、不需要特殊的仪器和适用范围广的RPA-IAC引物和内标及含有该RPA-IAC引物和内标的试剂盒。为了解决上述技术问题，本专利技术通过如下技术方案实现：本专利技术第一方面提供了一种引物对和内标扩增序列，所述引物对包含SEQIDNO-：1所示的核苷酸序列和SEQIDNO：2所示的核苷酸序列，所述内标扩增序列包含SEQIDNO：3所示的核苷酸序列。本专利技术第二方面提供了所述的引物对和内标扩增序列在制备筛查或辅助筛查大豆花叶病毒的产品中的应用。在一优选例中，所述制备筛查或辅助筛查大豆花叶病毒的产品包括：制备筛查或辅助筛查待测植物样品是否感染大豆花叶病毒的产品，以及制备筛查或辅助筛查待测病毒是否为或候选为大豆花叶病毒的产品。本专利技术第三方面提供了一种试剂盒，包括所述的引物对和包含有上述的内标扩增序列的质粒。在一优选例中，还包括RPA-IAC恒温扩增试剂。在一优选例中，所述RPA-IAC恒温扩增试剂包括来自TwistDX公司的RPA扩增试剂盒TwistAmpBasickits所包含的试剂。在一优选例中，还包括植物总RNA提取试剂。在一优选例中，所述植物总RNA提取试剂包括来自天根生物科技有限公司货号为DP432的植物总RNA提取试剂盒所包含的试剂。在一优选例中，还包括反转录试剂。在一优选例中，所述反转录试剂包括来自TaKaRa的货号为RR014A的PrimeScriptRT-PCRKit所包含的试剂。本专利技术第四方面提供了一种试剂盒在筛查或辅助筛查大豆花叶病毒，或制备筛查或辅助筛查大豆花叶病毒的产品中的应用；在一优选例中，所述筛查或辅助筛查大豆花叶病毒包括：筛查或辅助筛查待测植物样品是否感染大豆花叶病毒，以及筛查或辅助筛查待测病毒是否为或候选为大豆花叶病毒；在一优选例中，所述制备筛查或辅助筛查大豆花叶病毒的产品包括：制备筛查或辅助筛查待测植物样品是否感染大豆花叶病毒的产品，以及制备筛查或辅助筛查待测病毒是否为或候选为大豆花叶病毒的产品。本专利技术第五方面提供了一种筛查或辅助筛查大豆花叶病毒的方法，包括使用所述的引物对和包含有上述的内标扩增序列的质粒，或所述试剂盒的步骤。在一优选例中，所述筛查或辅助筛查大豆花叶病毒包括：筛查或辅助筛查待测植物样品是否感染大豆花叶病毒；以及筛查或辅助筛查待测病毒是否为或候选为大豆花叶病毒。在一优选例中，所述的方法包括如下步骤：1)RPA-IAC扩增从待测植物样品或待测病毒中提取总RNA，然后将其反转录成cDNA，再以cDNA为模板与所述的引物对和包含有上述的内标扩增序列的质粒，或所述试剂盒进行RPA-IAC扩增。2)根据RPA-IAC扩增的结果判断待测植物样品是否感染大豆花叶病毒，或待测病毒是否为或候选为大豆花叶病毒。在一优选例中，所述RPA-IAC扩增的结果判断的标准为：若所述RPA-IAC扩增得到的扩增产物仅有大小为154bp的目标基因片段，或同时拥有大小分别为338bp、154bp的内标扩增片段和目标基因片段，则判定为待测植物样品感染大豆花叶病毒或待测病毒为或候选为大豆花叶病毒；若所述RPA扩增得到的扩增产物只有大小为338bp的内标扩增片段，未含有大小为154bp的目标基因片段，则判定为待测植物样品未感染大豆花叶病毒或待测病毒不为或候选不为大豆花叶病毒；若所述RPA扩增得到的扩增产物未含有大小为338bp的内标扩增片段，同时也未含有大小为154bp的目标基因片段，判定为反应为假阴性，需要重新进行筛查。在一优选例中，步骤1)中从待测植物样品中提取总RNA是采用天根生物科技有限公司货号为DP432的植物总RNA提取试剂盒进行的；步骤1)中将总RNA反转录成cDNA是采用TaKaRa的货号为RR014A的PrimeScriptRT-PCRKit进行的。在一优选例中，所述RPA-IAC扩增的反应体系如下：含有冻干酶粉的0.2mLTwistAmp反应管再水化缓冲液29.5μLSEQIDNO：1所示的引物和SEQIDNO：2所示的引物各2μL，引物的终浓度均为0.4μmol/L在一优选例中，所述RPA-IAC扩增的反应条件如下：所述RPA-IAC扩增的温度为37℃，时间为40min。本专利技术提到的待测植物样品，可为植物的根﹑茎﹑叶等部分的成长的植物体；而待测病毒则是一种纯病毒或至少二种以上的病毒的混合。本专利技术涉及的“内标扩增片段”是添加到PCR反应体系中用以指示假阴性现象的一段人工构建DNA序列或者是一段致病菌的保守基因序列。扩增内标作用的主要原理是：将扩增内标添加到PCR反应体系中，使之与目的基因进行共同扩增，如果在反应体系中存在一些抑制因素，则扩增内标和目的基因的扩增反应都将受到抑制，从而达到指示PCR反应假阴性的目的。本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
引物对和内标扩增序列，其特征在于，所述引物对包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所述内标扩增序列包含SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.引物对和内标扩增序列，其特征在于，所述引物对包含SEQIDNO：1所示的核苷酸序列和SEQIDNO：2所示的核苷酸序列，所述内标扩增序列包含SEQIDNO：3所示的核苷酸序列。2.权利要求1所述的引物对和内标扩增序列在制备筛查或辅助筛查大豆花叶病毒的产品中的应用；任选的，所述制备筛查或辅助筛查大豆花叶病毒的产品包括：制备筛查或辅助筛查待测植物样品是否感染大豆花叶病毒的产品，以及制备筛查或辅助筛查待测病毒为或候选为大豆花叶病毒的产品。3.一种试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物对和包含有权利要求1所述的内标扩增序列的质粒。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：还包括RPA-IAC恒温扩增试剂；任选的，所述RPA-IAC恒温扩增试剂包括来自TwistDX公司的RPA扩增试剂盒TwistAmpBasickits所包含的试剂。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：还包括植物总RNA提取试剂；任选的，所述植物总RNA提取试剂包括来自天根生物科技有限公司货号为DP432的植物总RNA提取试剂盒所包含的试剂；任选的，还包括反转录试剂；任选的，所述反转录试剂包括来自TaKaRa的货号为RR014A的PrimeScriptRT-PCRKit所包含的试剂。6.权利要求3至5任一项所述的试剂盒在筛查或辅助筛查大豆花叶病毒，或制备筛查或辅助筛查大豆花叶病毒的产品中的应用；任选的，所述筛查或辅助筛查大豆花叶病毒包括：筛查或辅助筛查待测植物样品是否感染大豆花叶病毒，以及筛查或辅助筛查待测病毒是否为或候选为大豆花叶病毒；任选的，所述制备筛查或辅助筛查大豆花叶病毒的产品包括：制备筛查或辅助筛查待测植物样品是否感染大豆花叶病毒的产品，以及制备筛查或辅助筛查待测病毒是否为或候选为大豆花叶病毒的产品。7.一种筛查或辅助筛查大豆花叶病毒的方法，其特征在于：包括使用权利要求1所述的引物对和包含有权利要求1所述的内标扩增序列的质粒，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张永江，袁俊杰，相宁，魏霜，付伟，李桂芬，魏梅生，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11