双功能谷胱甘肽合成酶突变体、核苷酸序列及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种双功能谷胱甘肽合成酶突变体、核苷酸序列及其制备方法和应用，GshF突变体的氨基酸序列第3位、第123位、第161位、第194位、第382位和第390位中的至少一个位点与唾液链球菌野生型GshF氨基酸序列的相应位点氨基酸不同，从而获得了合成活性高、反应速率快、转化效率好的GshF突变体。其中GshF‑4突变体合成活力提高了12.8倍，比活提高了11倍，最适温度提高了20℃，在55℃条件下60min保持91.3％的活力，其固定化酶在50℃，pH8.0条件下催化合成GSH，反应60min，GSH浓度可达21g/L，可连续使用300批次以上，具有很好的操作稳定性。

Bifunctional glutathione synthetase mutant, nucleotide sequence, its preparation method and Application

The invention discloses a double function of glutathione synthase mutant, nucleotide sequence and its preparation and application, the corresponding amino acids of GshF mutant amino acid sequence third, 123rd, 161st, 194th, 382nd and 390th in at least one of the loci and Streptococcus salivarius wild type GshF amino acid sequence of different. To obtain a GshF mutant synthesis of high activity, fast reaction rate, good conversion efficiency. The GshF 4 mutant synthesis activity increased 12.8 times, the specific activity increased 11 times, the optimum temperature increased by 20 degrees, 55 degrees in the condition of 60min 91.3% to maintain its vitality, the immobilized enzyme at 50 degrees C, synthesis of GSH catalyzed pH8.0 reaction under the conditions of 60min, the concentration of GSH is 21g/L, can be used continuously over 300 batches, with good operational stability.

【技术实现步骤摘要】
双功能谷胱甘肽合成酶突变体、核苷酸序列及其制备方法和应用
本专利技术涉及双功能谷胱甘肽合成酶领域，特别地，涉及一种双功能谷胱甘肽合成酶突变体。此外，本专利技术还涉及一种包括上述双功能谷胱甘肽合成酶突变体的核苷酸序列及其制备方法和应用。
技术介绍
谷胱甘肽(Glutathione，简称GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成的，具有多种重要生理功能的活性三肽。在自然环境中，GSH存在2种形式，分别是还原型和氧化型，其中还原型GSH是细胞内主要还原物质，对于维持生物体内适宜的氧化还原环境起着至关重要的作用，能保护细胞免受氧化型、毒害性化合物和辐射的伤害。同时，GSH分子小，很容易被机体吸收，而且不容易被消化道酶破坏，GSH还是细胞内某些酶的辅因子，参与细胞内的代谢循环。由于其重要的生理功能，GSH在医学、食品、保健品及化妆品方面都有着广泛用途。GSH的生产方法有很多，工业生产主要有溶剂萃取法、化学合成法、酶法、发酵法。目前，在所有生产GSH的方法中，酶法和发酵法应用的最为广泛，他们同属于生物合成法。但是，发酵法相比酶法具有明显的缺点，比如：发酵生产周期长(通常为2-5天)，发酵液组分复杂后期提取困难，GSH产量低(4-8g/L)，发酵菌体总量大，废菌废渣废水难处理，不能进行多批次连续生产等。酶法生产GSH分为两步酶法和一步酶法。两步酶法是先以L-谷氨酸和L-半胱氨酸为底物，利用γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-ECL或GSHI)将其催化合成γ-谷氨酰基-L-半胱氨酸(γ-Glu-L-Cys)，再加入L-甘氨酸，通过谷胱甘肽合成酶(GS或GSHII)催化合成谷胱甘肽，具体反应如反应式A所示。一步酶法是利用双功能谷胱甘肽合成酶(GshF)，将底物L-谷氨酸、L-半胱氨酸和L-甘氨酸直接催化合成谷胱甘肽，具体反应如反应式B所示。由于双功能谷胱甘肽合成酶(GshF)同时具有GSHI和GSHII的活性，而且受产物GSH的反馈抑制作用比较小，催化效率更高，因此，GshF日益受到重视。双功能谷胱甘肽合成酶来源于非常广泛，许多微生物来源的GshF被国内外科研工作者发现、挖掘、筛选、克隆、表达和应用。对于双功能谷胱甘肽合成酶，国外研究人员已经开展相关工作并取得很大的进展，如BjornVergauwen等(ThejournalofBiologicalChemistryVol.281,NO:7,pp.4380-4394)发现来源于多杀巴斯德菌(Pasteurellamultocida)的谷胱甘肽合成酶同时具有γ-ECL和GS两种酶的活性，其与多种来源的γ-ECL进行序列比对，发现它们之间的同源性不高并将该酶命名为GshF，构建pGEM-gshF载体并在大肠杆菌K12中高表达，发现细胞内有46.2nmol/mg总蛋白的GSH存在，而对照组中没有发现GSH；Griffith等也报道了在无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)中存在类似的GshF；Aharonowitz等也发现了在单增李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)中也有相关的GshF；近几年，国内科研工作者也对GshF开展相应的研究并应用于生产GSH，如中国专利CN102586369A中，李志敏等对嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)来源的GshF进行基因克隆，表达并构建大肠杆菌基因工程菌，该重组菌经优化发酵条件，其GSH产量最高可以达到4.5g/L；如中国专利CN102071171A中，叶勤等克隆并表达了7种来源的GshF，其中重组菌JM109(pTrc99a-gshFap)比野生型大肠杆菌JM109在同样条件下反应合成的GSH高40多倍，经37℃体外反应6小时，GSH浓度可达到7.1g/L；如中国专利CN103122322A中，朱泰承等将来源于单增李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)的GshF编码基因插入pGAPZαA载体并转入毕赤酵母GS115中形成重组基因工程菌，该重组菌经发酵培养42小时后，其GSH浓度可以达到190mg/L。目前，在酶法生产GSH的过程中发现，野生型GshF的合成活性偏低，比活不高，受产物反馈抑制作用强，稳定性差等缺点，导致酶法生产GSH技术未能得到广泛应用。随着酶工程、基因工程和生物信息技术的发展，许多科研工作者运用理性设计、半理性设计和定向进化等手段对野生型GshF进行突变改造。如中国专利CN104328092A中，傅荣昭对来源于MelissococcusplutoniusATCC35311的GshF中的第128位、第256位及第320位进行定点突变，使其催化活性比野生型提高了2倍，其突变体固定化酶生产GSH的浓度可达到50mmol/L；如中国专利技术专利CN105238797A中，徐志南等对无乳链球菌来源的GshF进行突变，得到3种突变体gshFM1、gshFM2和gshFM3，所得的突变体编码基因被导入毕赤酵母菌中形成GSH重组生产菌，重组菌经发酵培养，最高GSH浓度达到837mg/L。虽然，国内外科研工作者利用基因工程及蛋白工程技术对双功能谷胱甘肽合成酶进行突变改造，使其合成活性有了成倍的提高，但是突变酶的合成活性还偏低、固定化酶使用批次还需进一步提高。因此，开发一种合成活性高和操作稳定性好的酶具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术提供了一种双功能谷胱甘肽合成酶突变体、核苷酸序列及其制备方法和应用，以解决突变酶的合成活性还偏低、固定化酶使用批次低的技术问题。本专利技术采用的技术方案如下：一种双功能谷胱甘肽合成酶突变体，双功能谷胱甘肽合成酶突变体的氨基酸序列第3位、第123位、第161位、第194位、第382位和第390位中的至少一个位点的氨基酸与SEQIDNO:2所示的唾液链球菌野生型双功能谷胱甘肽合成酶氨基酸序列的相应位点氨基酸不同，其余位点的氨基酸相同。进一步地，双功能谷胱甘肽合成酶突变体的氨基酸序列除第3位和/或第161位之外其余位点的氨基酸与唾液链球菌野生型双功能谷胱甘肽合成酶氨基酸序列相应位点的氨基酸相同。当第3位不同时，双功能谷胱甘肽合成酶突变体的氨基酸序列第3位的氨基酸为L。当第161位不同时，双功能谷胱甘肽合成酶突变体的氨基酸序列第161位的氨基酸为G或D。当第3和161位均不同时，双功能谷胱甘肽合成酶突变体的氨基酸序列第3位的氨基酸为L且第161位为D，即为SEQIDNO:4所示的氨基酸序列GshF-2。进一步地，双功能谷胱甘肽合成酶突变体的氨基酸序列除第123位和/或第194位之外其余位点的氨基酸与氨基酸序列GshF-2相应位点的氨基酸相同。当第123位不同时，双功能谷胱甘肽合成酶突变体的氨基酸序列第123位的氨基酸为F或Y。当第194位不同时，双功能谷胱甘肽合成酶突变体的氨基酸序列第6位的氨基酸为S。当第123和194位均不同时，双功能谷胱甘肽合成酶突变体的氨基酸序列第123位的氨基酸为Y且第194位为S，即为SEQIDNO:6所示的氨基酸序列GshF-3。进一步地，双功能谷胱甘肽合成酶突变体的氨基酸序列除第382位和第390位之外其余位点的氨基酸与氨基酸序列GshF-3相应位点的氨基酸相同。双功能谷胱甘肽合成酶突变体的氨基酸序列第本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双功能谷胱甘肽合成酶突变体，其特征在于，所述双功能谷胱甘肽合成酶突变体的氨基酸序列第3位、第123位、第161位、第194位、第382位和第390位中的至少一个位点的氨基酸与SEQ ID NO:2所示的唾液链球菌野生型双功能谷胱甘肽合成酶氨基酸序列的相应位点氨基酸不同，其余位点的氨基酸相同。

【技术特征摘要】
1.一种双功能谷胱甘肽合成酶突变体，其特征在于，所述双功能谷胱甘肽合成酶突变体的氨基酸序列第3位、第123位、第161位、第194位、第382位和第390位中的至少一个位点的氨基酸与SEQIDNO:2所示的唾液链球菌野生型双功能谷胱甘肽合成酶氨基酸序列的相应位点氨基酸不同，其余位点的氨基酸相同。2.根据权利要求1所述的双功能谷胱甘肽合成酶突变体，其特征在于，所述双功能谷胱甘肽合成酶突变体的氨基酸序列除第3位和/或第161位之外其余位点的氨基酸与所述唾液链球菌野生型双功能谷胱甘肽合成酶氨基酸序列相应位点的氨基酸相同；当第3位不同时，所述双功能谷胱甘肽合成酶突变体的氨基酸序列第3位的氨基酸为L；当第161位不同时，所述双功能谷胱甘肽合成酶突变体的氨基酸序列第161位的氨基酸为G或D；当第3和161位均不同时，所述双功能谷胱甘肽合成酶突变体的氨基酸序列第3位的氨基酸为L且第161位为D，即为SEQIDNO:4所示的氨基酸序列GshF-2。3.根据权利要求2所述的双功能谷胱甘肽合成酶突变体，其特征在于，所述双功能谷胱甘肽合成酶突变体的氨基酸序列除第123位和/或第194位之外其余位点的氨基酸与所述氨基酸序列GshF-2相应位点的氨基酸相同；当第123位不同时，所述双功能谷胱甘肽合成酶突变体的氨基酸序列第123位的氨基酸为F或Y；当第194位不同时，所述双功能谷胱甘肽合成酶突变体的氨基酸序列第6位的氨基酸为S；当第123和194位均不同时，所述双功能谷胱甘肽合成酶突变体的氨基酸序列第123位的氨基酸为Y且第194位为S，即为SEQIDNO:6所示的氨基酸序列GshF-3。4.根据权利要求3所述的双功能谷胱甘肽合成酶突变体，其特征在于，所述双功能谷胱甘肽合成酶突变体的氨基酸序列除第382位和第390位之外其余位点的氨基酸与所述氨基酸序列GshF-3相应位点的氨基酸相同；所述双功能谷胱甘肽合成酶突变体的氨基酸序列第382位的氨基酸为Q且第390位的氨基酸为P，即为SEQIDNO:8所示的氨基酸序列GshF-4。5.一种双功能谷胱甘肽合成酶突变体的核苷酸序列，其特征在于，所述双功能谷胱甘肽合成酶突变体的氨基酸序列包括GshF-2、GshF-3和GshF-4，所述双功能谷胱甘肽合成酶突变体的...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄斌，周晶辉，赵强，熊孟玲，刘婧莹，曾红宇，许岗，
申请(专利权)人：湖南福来格生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43