一种蔗糖磷酸化酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术属于酶工程领域，涉及一种蔗糖磷酸化酶突变体及其应用。所述的蔗糖磷酸化酶突变体在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的野生型酶中突变多个氨基酸位点。利用本发明专利技术的蔗糖磷酸化酶突变体及其制备抗坏血酸葡糖苷的方法，能够使得突变体较野生型蔗糖磷酸化酶具有更高的比活力，更高的转化收率。更高的转化收率。更高的转化收率。

【技术实现步骤摘要】
一种蔗糖磷酸化酶突变体及其应用


[0001]本专利技术属于酶工程
，涉及一种蔗糖磷酸化酶(Spase)突变体及其应用。

技术介绍

[0002]L
‑
抗坏血酸分子中存在极不稳定的连烯二醇结构，极易被热和氧化剂破坏，尤其是光、重金属和荧光物质都能促进其氧化，使其应用受到很大限制。抗坏血酸葡萄糖苷(AA
‑
2G)是L
‑
抗坏血酸的衍生物，分子式为C12H18O11,该物质是在糖基转移酶的作用下,由吡喃型葡萄糖苷和L
‑
抗坏血酸缩合而成,其中抗坏血酸分子上2位碳上的羟基被吡喃型葡萄糖苷所取代，吡喃型葡萄糖苷以β
‑
1,4
‑
糖苷键连接。因为2位碳上有葡萄糖基掩蔽,所以AA
‑
2G具有非还原性，与抗坏血酸相比，稳定性更高，同时更易于吸收和利用。
[0003]AA
‑
2G具有非还原性，不易发生氧化反应，其水溶液特别稳定；AA
‑
2G具有较好的耐光性和耐热性；AA
‑
2G能被α
‑
葡萄糖苷酶水解生成抗坏血酸和葡萄糖，因此可以发挥抗坏血酸的功效；AA
‑
2G对于清除自由基，促进胶原合成具有更为持久的作用效果。
[0004]多种知名品牌的化妆品都使用AA
‑
2G这种新型稳定的抗坏血酸衍生物作为美白添加剂，如法国欧莱雅、德国兰蔻、日本资生堂等。目前市场上的AA
‑
2G主要由日本林原国际有限公司合成，该公司申报若干相关专利对相关合成技术加以保护，形成市场垄断。
[0005]AA
‑
2G作为人工合成的抗坏血酸衍生物，生物转化是其现今唯一的生产方式。其化学合成的方法也有学者进行过探究，但结果表明该方案合成过程复杂、成本过高，与工业化生产差距甚远。
[0006]AA
‑
2G的生物转化最早由日本林原生物化学研究所和冈山大学药学系实现，以可溶性淀粉和抗坏血酸为底物，在环糊精葡聚糖转移酶的作用下进行AA
‑
2G的生产。近年来国内外学者也对其合成方法进行不断研究，取得一系列的研究成果。目前，环糊精糖基转移酶(CGTase,EC2.4.1.19)、α
‑
淀粉酶(EC3.2.1.1)、α
‑
葡萄糖苷酶(EC3.2.1.20)、α
‑
异麦芽糖基葡萄糖形成酶、蔗糖磷酸化酶(EC2.4.1.7)是常用的5种合成AA
‑
2G的酶。
[0007]长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)来源的磷酸化酶作为一种转化生产AA
‑
2G的新酶来源,在2007年被韩国研究者发现。其以蔗糖为糖基供体生产AA
‑
2G，对于该酶的研究尚在实验室阶段,离实现工业化还有一定距离，目前国内外也在针对该酶进行研究,但尚未见该酶生产AA
‑
2G的报道。

技术实现思路

[0008]本专利技术的首要目的是提供一种蔗糖磷酸化酶突变体，以能够使突变体较野生型蔗糖磷酸化酶具有更高的比活力，并能在催化制备抗坏血酸葡萄糖苷时具有更高的产物收率，为实现工业化生产奠定基础。
[0009]为实现此目的，在基础的实施方案中，本专利技术提供一种蔗糖磷酸化酶突变体，
[0010]所述的突变体是在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的野生型蔗糖磷酸化酶中突变G52D、H273Q、D314S中至少一个氨基酸位点。
[0011]G52D、H273Q、D314S分别表示：第52位氨基酸由G突变为D；第273位氨基酸由H突变为Q、第314位氨基酸由D突变为S。
[0012]进一步地：突变的氨基酸位点为G52D、H273Q、D314S中任一个或两个。
[0013]进一步地：突变的氨基酸位点为G52D。
[0014]进一步地：突变的氨基酸位点为H273Q和D314S或者G52D和D314S。
[0015]进一步地：突变的氨基酸位点为G52D和H273Q和D314S。
[0016]本专利技术的第二个目的是提供一种编码上述的蔗糖磷酸化酶突变体的多核苷酸。
[0017]本专利技术的第三个目的是提供所述的蔗糖磷酸化酶突变体的应用，以蔗糖和抗坏血酸为底物，催化合成抗坏血酸葡萄糖苷。
[0018]进一步地，酶的添加量为100
‑
150U，优选150U，底物浓度：蔗糖1.00
‑
1.50M，优选1.46M，抗坏血酸1.00
‑
1.50M，优选1.50M。
[0019]进一步地，反应在30℃
‑
37℃下进行，优选37℃；反应时间至少1h，优选8
‑
10h。
[0020]进一步地，反应所需的pH条件为5.00
‑
5.50，优选5.20。
[0021]本专利技术的有益效果在于，本专利技术的蔗糖磷酸化酶突变体较野生型蔗糖磷酸化酶具有更高的比活力，并能在催化制备抗坏血酸葡萄糖苷时具有更高的产物收率。
[0022]本专利技术选择长双歧杆菌Bifidobacterium longum来源的蔗糖磷酸化酶Spase作为出发点，其相比其它来源的蔗糖磷酸化酶有以下优势：酶活力高、催化效率高、最终产物浓度高。在此基础上，本专利技术通过基因工程及酶工程技术手段，对Spase进行突变，所获得的蔗糖磷酸化酶合成酶突变体较Spase具有酶比活力、催化速率和转化收率更高，酶更稳定等优点，因此更适用于抗坏血酸葡萄糖苷的制备。
[0023]以下结合实施例和附图对本专利技术作出进一步的说明，而不会形成对本专利技术的限制。
附图说明：
[0024]图1为蔗糖磷酸化酶制备抗坏血酸葡萄糖苷的原理图。
具体实施方式：
[0025]其中Spase及其突变体的酶活力的测定方法如下。
[0026]反应底物组成：抗坏血酸:蔗糖＝250mM:250mM
[0027]称取抗坏血酸4.40g，蔗糖8.55g，用100mM pH5.0醋酸钠
‑
醋酸缓冲液溶解，调pH5.0，并定容到100mL。
[0028]酶活测定：取0.5mL样品(或稀释后样品)于1.5mL规格的离心管中(离心管中预先加入一定量的玻璃珠，以离心管刻度1.0mL处为宜)，在MS3振荡器上振荡20min(振荡器振荡频率设为1500/min)后，将样品稀释(用水稀释)到合适的线性范围进行检测(0
‑
4.5U),取适量稀释后样品于50mL试管中，用生理盐水补足5mL，加入已预热至37℃的底物溶液10mL，于37℃的水浴中搅拌反应10min后，加入25％的三氯乙酸溶液2mL终止反应，摇匀后离心，精确量取上清液1mL于50mL容量瓶中，用水定容后进行HPLC分析。
[0029]HPLC分析：
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种蔗糖磷酸化酶突变体，其特征在于：所述的突变体是在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的野生型蔗糖磷酸化酶中突变G52D、H273Q、D314S中至少一个氨基酸位点。2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于：突变的氨基酸位点为G52D、H273Q、D314S中任一个或两个。3.根据权利要求2所述的突变体，其特征在于：突变的氨基酸位点为G52D；或者G52D和D314S；或者H273Q和D314S。4.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于：突变的氨基酸位点为G52D和RH273Q和D314S。5.一种编码权利要求1
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4任意一项所述的蔗糖磷酸化酶突变体的多核苷酸。6.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：华垚堃，张羽桑，周晶辉，赵强，罗红辉，赵士敏，许岗，
申请(专利权)人：湖南福来格生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：