一种生物结合化学法制备D-脯氨酸的方法技术

本发明专利技术属于生物技术和化工结合领域，涉及一种生物结合化学法制备D

【技术实现步骤摘要】
一种生物结合化学法制备D
‑
脯氨酸的方法


[0001]本专利技术属于生物技术和化工领域，涉及一种生物结合化学法制备D
‑
脯氨酸的方法，更具体的是一种基因工程重组菌株E.coli BL21/pETDuet
‑
RacE
‑
Dglucy的构建，以及利用其催化产物结合化学合成D
‑
脯氨酸的方法。

技术介绍

[0002]D
‑
脯氨酸(D
‑
proline，分子式：C5H9NO2，CAS号：344
‑
2532)是一类重要的手性试剂和手性中间体。既可用作拆分试剂和手性试剂，也可以作为合成某些手性药物的手性中间体，如可以作为抗偏头痛药物依来曲普坦的关键手性中间体。依来曲普坦(Eletriptan)是由辉瑞公司开发的于2001年首次在澳大利亚上市，后续在多个国家上市，市场需求量较大，其作用原理主要是通过激活人体内5
‑
HT1相关受体抑制神经肽释放，收缩颅内血管丙抑制神经性炎症发挥抗偏头痛效应；此外，D
‑
脯氨酸还是合成一叶萩型生物碱(
‑
)
‑
securinine A的关键前体，该生物碱用于临床治疗小儿麻痹症、肌萎缩侧索硬化症和慢性再生障碍性贫血等疾病；并且，D
‑
脯氨酸还是合成(R)
‑
Harmicine的关键前体，该物质是一种具有多重药理活性的β
‑
咔啉生物碱。而作为不对称的有机催化剂是由于D
‑
脯氨酸具有刚性构象，可以作为不对称有机催化剂催化多个反应如不对称Mannich反应、aldol反应、Mannich
–
Aza Michael反应、Morita
‑
Bayllis
‑
Hillman反应、Heck交叉偶联反应、多组分反应，用于合成各种结构的手性分子。综上，D
‑
脯氨酸无论是作为手性试剂还是作为医药中间体都具有重要的价值，具有广阔的市场前景。
[0003]目前，D
‑
脯氨酸的制备方法可以分为化学法和生物法两种。化学法目前工业上主要是通过采用化学不对称转化技术制备，该技术是以L
‑
脯氨酸为原料，正丁醛为催化剂，在正丁酸溶剂中与L
‑
酒石酸反应制备D
‑
脯氨酸
‑
L
‑
酒石酸盐，然后在甲醇中用氨水处理得到D
‑
脯氨酸，该方法主要存在生产成本偏高、环境污染大等问题；另一种化学方法制备D
‑
脯氨酸是以吡咯烷
‑2‑
甲醛为原料，不对称还原为D
‑
脯氨醇，然后氧化为D
‑
脯氨酸，但是该方法需要采用昂贵的原料和手性金属催化剂，D
‑
脯氨酸的对映体过量(enantiomeric excess，ee)值也不高。
[0004]生物法制D
‑
脯氨酸的方法主要有生物不对称合成法制备、生物拆分法制备、对映选择性降解法制备D
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脯氨酸。其中，生物不对称合成法主要是以L
‑
精氨酸为原料，化学合成L
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Cl
‑
精氨酸，利用微生物菌体将其水解为(S)
‑5‑
氨基
‑2‑
氯戊酸，然后自动反转、关环为D
‑
脯氨酸，该路线成本非常高，不适合工业化应用；生物拆分法主要是利用一种特异性的酶去作用于DL
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脯氨酸衍生物中的L
‑
脯氨酸衍生物，而D
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脯氨酸衍生物得到保留。L
‑
脯氨酸衍生物被酶催化后还原为L
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脯氨酸，分离出的L
‑
脯氨酸可作为制备DL
‑
脯氨酸的原料；对映体选择降解法制备主要是以DL
‑
脯氨酸为原料，通过特定微生物在培养基中生长的同时降解DL
‑
脯氨酸中的L
‑
脯氨酸，D
‑
脯氨酸得到保留。该法的优点是环境污染较轻，但是制备的产量较低，依赖于底物DL
‑
脯氨酸原材料，所制备D
‑
脯氨酸的成本高，无法工业化应用。
[0005]由于生物法制备D
‑
脯氨酸的技术和成本问题，市场上现有技术为化学法生产，因
此，针对于现有化学法、生物法制备D
‑
脯氨酸的关键问题，开发更为高效、低成本的D
‑
脯氨酸合成工艺技术具有重要的价值和意义。

技术实现思路
：
[0006]本专利技术提供了一种生物酶法催化+化学法合成D
‑
脯氨酸的路线，相比单一的化学法和生物催化方法，选用了更为廉价易得的底物L
‑
谷氨酸作为前体物质，不受原材料来源限制，酶法催化步骤反应完全，得率更高，化学法反应完全，产物手性纯度更高，为一条全新的D
‑
脯氨酸合成路线。
[0007]为实现此目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0008]一种生物结合化学法制备D
‑
脯氨酸的方法，包括以下步骤：
[0009]1)含有谷氨酸消旋酶基因和D
‑
谷氨酸环化酶基因共表达载体的基因工程菌作为催化剂，用L
‑
谷氨酸为前体，催化合成D
‑
脯氨酸前体5
‑
氧代
‑
D
‑
脯氨酸；
[0010]2)以5
‑
氧代
‑
D
‑
脯氨酸化学法合成D
‑
脯氨酸。
[0011]所述的方法，
[0012]谷氨酸消旋酶基因和D
‑
谷氨酸环化酶基因构建至表达载体；将共表达载体转化至表达菌株中，抗生素筛选后即为含有谷氨酸消旋酶和D谷氨氨酸环化酶基因的工程重组菌株。
[0013]进一步地，
[0014]谷氨酸消旋酶基因和D
‑
谷氨酸环化酶基因构建至大肠杆菌原核表达载体pETDuet
‑
1，其中谷氨酸消旋酶基因构建至pETDuet
‑
1中的多克隆位点MCS1中，基因5
’
端带有NcoI酶切位点，基因3
’
端带有HindIII酶切位点；D
‑
谷氨酸环化酶基因构建至pETDuet
‑
1的多克隆位点MCS2中，基因5
’
端带有NdeI酶切位点，基因3
’
端带有XhoI酶切位点；将共表达质粒构建至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，抗生素筛选后即为含有谷氨酸消旋酶和D谷氨氨酸环化酶基因的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生物结合化学法制备D
‑
脯氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)含有谷氨酸消旋酶基因和D
‑
谷氨酸环化酶基因共表达载体的基因工程菌作为催化剂，用L
‑
谷氨酸为前体，催化合成D
‑
脯氨酸前体5
‑
氧代
‑
D
‑
脯氨酸；2)以5
‑
氧代
‑
D
‑
脯氨酸化学法合成D
‑
脯氨酸。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，谷氨酸消旋酶基因和D
‑
谷氨酸环化酶基因构建至表达载体；将共表达载体转化至表达菌株中，抗生素筛选后即为含有谷氨酸消旋酶和D谷氨氨酸环化酶基因的工程重组菌株。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，谷氨酸消旋酶基因和D
‑
谷氨酸环化酶基因构建至大肠杆菌原核表达载体pETDuet
‑
1，其中谷氨酸消旋酶基因构建至pETDuet
‑
1中的多克隆位点MCS1中，基因5
’
端带有NcoI酶切位点，基因3
’
端带有HindIII酶切位点；D
‑
谷氨酸环化酶基因构建至pETDuet
‑
1的多克隆位点MCS2中，基因5
’
端带有NdeI酶切位点，基因3
’
端带有XhoI酶切位点；将共表达质粒构建至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，抗生素筛选后即为含有谷氨酸消旋酶和D谷氨氨酸环化酶基因的工程重组菌株E.coli BL21/pETDuet
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RacE
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Dglucy。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的方法，其特征在于，谷氨酸消旋酶基因RacE的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；D
‑
谷氨酸环化酶基因Dglucy的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，工程菌发酵过程为：从LB的固体培养基上挑取单菌落接种于LB液体培养基中，180
‑
220rpm，30
‑
37℃振荡过夜培养，次日按照0.5
‑
2％接种量接种至TB发酵培养基中，180
‑
220rpm，30
‑
37℃振荡培养4
‑
6h，待OD
600nm＝
0.4
‑
0.6时，添加终浓度为0.5
‑
1％的乳糖，180
‑
220rpm，25
‑
30℃诱导培养8
‑
12h，收集菌体，进行后续的全细胞催化合成反应。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，催化合成D
‑
脯氨酸前体5<...

【专利技术属性】
技术研发人员：周晶辉，许岗，曾红宇，黄毅，赵强，赵士敏，
申请(专利权)人：湖南福来格生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：