一种苏氨酸转醛酶突变体、载体、菌株以及它们的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种苏氨酸转醛酶突变体、载体、菌株以及它们的应用。所述的苏氨酸转醛酶突变体是在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中突变了多个氨基酸位点。利用本发明专利技术的苏氨酸转醛酶突变体，以对甲砜基苯甲醛和L

【技术实现步骤摘要】
一种苏氨酸转醛酶突变体、载体、菌株以及它们的应用


[0001]本专利技术属于酶工程
，涉及一种苏氨酸转醛酶突变体、载体、菌株以及它们的应用。

技术介绍

[0002](2S,3R)
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对甲砜基苯丝氨酸是合成氟苯尼考的关键中间体。氟苯尼考是一种广谱抗菌药物,具有吸收快，半衰期长，不易产生耐药性，无残留，无交叉耐药性等优点，主要用于牛、猪、鸡鸭、鱼等动物的细菌性疾病，是替代氯霉素和甲砜霉素的新一代氯霉素类抗生素。近年来，我国氟苯尼考的生产和出口量不断增长，已被列入我国医药原料药年出口金额1亿美元以上的品种名单中，市场需求量极大。因此，针对(2S,3R)
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对甲砜基苯丝氨酸进行研究，开发出一种绿色高效、经济环保的制备方法备受关注。
[0003]目前，国内外工业生产(2S,3R)
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对甲砜基苯丝氨酸的主要方法是化学拆分DL
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对甲砜基苯丝氨酸乙酯，得到具有光学活性的对甲砜基苯丝氨酸乙酯，然后经碱水解制备(2S,3R)
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对甲砜基苯丝氨酸。具体是以对甲砜基苯甲醛和甘氨酸为原料，在硫酸铜和氨水存在的条件下，通过羟醛缩合反应生成对甲砜基苯丝氨酸，酯化得到对甲砜基苯丝氨酸乙酯，再先后经D
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酒石酸拆分和碱水解得到(2S,3R)
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对甲砜基苯丝氨酸。虽然该反应路线简单，但反应条件剧烈，同时用到强酸、强碱和硫化氢气体，产生大量的废水、废气和固体废弃物，对环境危害大，同时，需要用到昂贵的手性拆分试剂D<br/>‑
酒石酸，且反应总收率只有32％
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37％，工业化应用生产成本高。
[0004]近年来，广大的生物工作者利用生物酶法催化合成了(2S,3R)
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对甲砜基苯丝氨酸，避开化学法合成中的诸多缺点，实现了高效绿色的不对称合成反应。如授权专利CN110540977B，名称为：一种L
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苏氨酸转醛酶在氟苯尼考手性中间体合成中的应用，公开报道了一种采用苏氨酸转醛酶全细胞，可在常温常压下催化反应合成(2S,3R)
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对甲砜基苯丝氨酸。授权专利CN110951799B，名称为：“一菌多酶”全细胞不对称合成(2S,3R)
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对甲砜基苯丝氨酸的方法，提供了一种苏氨酸转醛酶(PsLTTA)、乙醇脱氢酶(ApADH)和甲酸脱氢酶(CbFDH)共表达的大肠杆菌BL21(DE3)工程菌株，可实现(2S,3R)
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对甲砜基苯丝氨酸的不对称高效生物合成，同时解除了副产物乙醛对PsLTTA的抑制作用。上述方法中，虽然公开了(2S,3R)
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对甲砜基苯丝氨酸的酶法合成路线，但采用的都是野生型苏氨酸转醛酶，催化反应活性低，生产成本高。
[0005]为解决苏氨酸转醛酶低活性的问题，我们以假单胞菌属来源的苏氨酸转醛酶PsLTTA为出发点，通过构建突变体文库和定向筛选，获得了一系列的高活力、高转化率的突变体酶(最佳突变体的活力提高了5倍以上，非对映体过量de值提高了1％以上)，为实现酶法生产(2S,3R)
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对甲砜基苯丝氨酸的工业化应用奠定了基础。

技术实现思路

[0006]本专利技术的首要目的是提供苏氨酸转醛酶突变体，相比较野生型PsLTTA具有更高的
催化活力，并能以对甲砜基苯甲醛和L
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苏氨酸为原料催化制备(2S,3R)
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对甲砜基苯丝氨酸时，具有更高的转化收率和产物de值。
[0007]为实现此目的，在基础的实施方案中，本专利技术提供一种苏氨酸转醛酶突变体，所述的突变体在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的苏氨酸转醛酶PsLTTA中突变多个氨基酸位点，突变的氨基酸位点包括F320Y、N342D和K378D中的一个或多个。
[0008]进一步地，突变方式包括以下7种中的任一种：F320Y；N342D；K378D；F320Y/N342D；F320Y/K378D；N342D/K378D；F320Y/N342D/K378D；
[0009]优选：N342D；K378D；F320Y/N342D；F320Y/K378D；N342D/K378D；F320Y/N342D/K378D中的任一种。
[0010]更进一步地：突变方式包括以下4种中的任一种：F320Y/N342D；F320Y/K378D；N342D/K378D；F320Y/N342D/K378D。
[0011]更进一步地：突变方式包括以下3种中的任一种：F320Y/K378D；N342D/K378D；F320Y/N342D/K378D。
[0012]更进一步地：突变方式包括以下2种中的任一种：N342D/K378D；F320Y/N342D/K378D。
[0013]本专利技术第二个目的是提供编码上述的苏氨酸转醛酶突变体的多核苷酸，以能够使编码的苏氨酸转醛酶突变体较野生型苏氨酸转醛酶PsLTTA具有更高的催化活力，更高的转化收率和产物de值。
[0014]本专利技术第三个目的是提供含有上述的苏氨酸转醛酶突变体的多核苷酸的载体。
[0015]本专利技术第四个目的是提供含有上述的载体的菌株。
[0016]本专利技术的第五个目的是提供一种制备(2S,3R)
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对甲砜基苯丝氨酸的方法，以能够更好的制备(2S,3R)
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对甲砜基苯丝氨酸。
[0017]为实现此目的，在基础的实施方案中，本专利技术提供一种制备(2S,3R)
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对甲砜基苯丝氨酸的方法，所述的方法是在反应体系中，用前述的苏氨酸转醛酶突变体，以对甲砜基苯甲醛和L
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苏氨酸为原料制备(2S,3R)
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对甲砜基苯丝氨酸。
[0018]在一种优选的实施方案中，本专利技术提供一种制备对甲砜基苯丝氨酸的方法，其中所述反应的反应温度为22
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28℃，底物L
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苏氨酸浓度为500
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600mM，对甲砜基苯甲醛浓度为250
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300mM，辅酶磷酸吡哆醛为0.1
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0.5mM，氯化镁浓度为10
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30mM，NAD+浓度为0.1
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0.5mM，甲酸铵为500
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600mM；底物溶剂为0.5
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0.1mol/L磷酸盐缓冲液，反应pH 6.5
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7.0，反应时间7
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10h，苏氨酸转醛酶活力为200
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300U，甲酸脱氢酶活力为100
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200U，乙醇脱氢酶活力为200
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300U，反应体系50ml。
[0019]本专利技术的有益效果在于，利用本专利技术的苏氨酸转醛酶突变体制备(2S,3R)
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对甲砜基苯丝氨酸，与突变之前的酶相比，具有更高的活力、更高的转化收率本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种苏氨酸转醛酶突变体，其特征在于：在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中进行突变，突变的氨基酸位点包括F320Y、N342D、K378D中的一个或多个。2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于：突变方式包括以下7种中的任一种：F320Y；N342D；K378D；F320Y/N342D；F320Y/K378D；N342D/K378D；F320Y/N342D/K378D；优选：N342D；K378D；F320Y/N342D；F320Y/K378D；N342D/K378D；F320Y/N342D/K378D中的任一种。3.根据权利要求2所述的突变体，其特征在于：突变方式包括以下4种中的任一种：F320Y/N342D；F320Y/K378D；N342D/K378D；F320Y/N342D/K378D。4.根据权利要求3所述的突变体，其特征在于：突变方式包括以下3种中的任一种：F320Y/K378D；N342D/K378D；F320Y/N342D/K378D。5.根据权利要求4所述的突变体，其特征在于：突变方式包括以下2种中的任一种：N342D/K378D；F320Y/N342D/K378D。6.一种编码权利要求1
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5任一项所述的苏氨酸转醛酶突变体的多核苷酸。7.含有权利要求6所述的苏氨酸转醛酶突变体的多核苷酸的载体。8.含有权利要求7所述的载体的菌株。9.一种苏氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵强，许岗，刘亚，李冰清，赵士敏，周晶辉，刘洋，
申请(专利权)人：湖南福来格生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：