一种具有耐碱性的氧化硫化酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种具有耐碱性的氧化硫化酶突变体及其应用。本发明专利技术的氧化硫化酶突变体的突变为选自以下突变位点中的至少一个：第86位氨基酸从V突变为S，第292位的氨基酸L突变为A，第348位氨基酸从T突变为K；本发明专利技术中所述的氧化硫化酶突变体制备麦角硫因的周期短、产量高，并且提高了其耐碱性及催化活性，使得碱性条件下制备麦角硫因的效率显著提高。条件下制备麦角硫因的效率显著提高。

【技术实现步骤摘要】
一种具有耐碱性的氧化硫化酶突变体及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种具有耐碱性的氧化硫化酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]麦角硫因(Ergothioneine,EGT)，又名2
‑
巯基
‑
L
‑
组氨酸三甲基内盐，是一种天然的稀有氨基酸，自然界中含量较低且在绝大多数生物体中的含量极少，不能由动物机体自身合成，只能通过饮食等方式从外界环境中摄取。EGT主要以硫醇和硫酮两种形式的异构体存在，其纯品为白色晶体，无色无味，能溶于水，因为巯基的稳定性不如硫羰基高，故麦角硫因主要以硫酮的形式存在，在生理pH或者强碱溶液中不会自身氧化。1909年，Tanret首次从麦角菌Claviceps purpurea(寄生在禾本科植物黑麦上的一种真菌)中分离并得到该物质。麦角硫因具有极强的抗氧化活性、抗炎作用、抗应激作用、抗细胞衰老作用、抑制皱纹形成作用和抑制肿瘤发生等多种生理功效。由于麦角硫因的上述功能，决定了它在医药、食品、保健品、化妆品及生物技术等领域具有广泛的市场前景。
[0003]在相关技术中，麦角硫因可以经化学合成、提取法和生物发酵获得。而化学方法合成左旋的麦角硫因十分困难，且合成原料昂贵，成本高，产品安全性难以保证，限制了麦角硫因的应用。提取法主要是从大型真菌的子实体、麦角、谷物、猪血和动物组织中提取麦角硫因。在相关技术中，发现了麦角硫因广泛存在于食药用菌中，虽然食药用菌子实体中麦角硫因含量可观，但在大规模工业生产中使用提取法往往是不合适的，因为这一种方法中食用菌子实体栽培时间长，成本较高，且得到的麦角硫因杂质多，产出率低。
[0004]麦角硫因生物合成途径大致可分为两种，一种是在细菌中由EgtABCDE基因簇编码的5个酶进行连续催化合成的途径；另一种是在真菌中由Egt1、Egt2两个酶催化的合成途径。目前已报道的利用微生物发酵生产麦角硫因的相关文献较多，尽管深层发酵法是目前麦角硫因工业化生产的主要方法，但是也面临着发酵周期长，产物产率低，分离困难的问题。上述缺陷使得现有的生物法无法真正实现麦角硫因的大规模工业化生产，因此，迫切需要一种能够周期短、产量高、成本低、途经简单的新方法制备麦角硫因。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种具有耐碱性的氧化硫化酶突变体，能够提高氧化硫化酶在催化生产麦角硫因中的效率，提高了其耐碱性及催化活性，使得碱性条件下制备麦角硫因的效率显著提高。
[0006]本专利技术还提出编码上述突变体的核酸分子。
[0007]本专利技术还提出一种重组载体。
[0008]本专利技术还提出一种重组宿主细胞。
[0009]本专利技术还提出一种产品。
[0010]本专利技术还提出一种生产上述氧化硫化酶突变体的方法。
[0011]本专利技术还提出上述氧化硫化酶的突变体或重组宿主细胞在生产麦角硫因中的应用。
[0012]本专利技术的第一个方面，提供一种氧化硫化酶的突变体，所述突变体具有如SEQ ID NO.1所示的氧化硫化酶氨基酸序列经以下任一种氨基酸置换后的氨基酸序列：第86位氨基酸从V突变为S；第292位的氨基酸L突变为A；第348位氨基酸从T突变为K。
[0013]在本专利技术的一些实施方式中，所述氧化硫化酶是来自克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)的氧化硫化酶KsEanB。
[0014]在本专利技术的一些实施方式中，所述氧化硫化酶KsEanB的氨基酸序列为：
[0015]MKRVSQLTALAMLCGLASFSSLAADMPHAMTLSQLQAQHGAVIDTRASAFYNGWPQTLSAPSGHEPAALNLSASWLGAMSDDQIAVWARQHQLTPAMTIALYGRDADNQAVKTRLEKAGYHQISVLNDALQVPERLQRLPHFEQLVYPEWIHRLQQGKPVTAAPTGDWKVIEAAWGAPKFYLLNHIPGAGYIDTNEVESEPLWNKVSDDTLKAMLAKHGIRHDTTVILYGRDVYAAARVAQIMLYAGVKDVRILDGGWKAWSDAGLPVERGMPKDVKPAPDFGAPIPGQPQLMVDMAQARGMLHRQDASLVSIRSWPEFIGETSGYSYIKPKGEIAGARWGHAGSDATHMEDFHNPDGTMRSADDIAAMWKTWNILPEQHVAFYCGTGWRASETFMYARAMGWKNVAVYDGGWYEWSSHPQNPVSSGKRGPESTR(SEQ ID NO.1)。
[0016]在本专利技术的一些实施方式中，所述氧化硫化酶的突变体的氨基酸序列包括如下(1)
‑
(5)中的任意一种：
[0017](1)SEQ ID NO.2；
[0018](2)SEQ ID NO.3；
[0019](3)SEQ ID NO.4；
[0020](4)SEQ ID NO.5；
[0021](5)SEQ ID NO.6。
[0022]在本专利技术的一些实施方式中，所述SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中，氨基酸置换位点为V86S，所述氨基酸序列为：
[0023][0024]在本专利技术的一些实施方式中，所述SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列中，氨基酸置换位点为L292A，所述氨基酸序列为：
[0025][0026]在本专利技术的一些实施方式中，所述SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列中，氨基酸置换位点为T348K，所述氨基酸序列为：
[0027][0028][0029]在本专利技术的一些实施方式中，所述SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列中，氨基酸置换位点为V86S/L292A，所述氨基酸序列为：
[0030][0031]在本专利技术的一些实施方式中，所述SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列中，氨基酸置换位点为V86S/L292A/T348K，所述氨基酸序列为：
[0032][0033]其中，上述氨基酸序列中加粗且标有下划线的部分分别为氨基酸置换后的第86位的丝氨酸，第292位的丙氨酸，第348的赖氨酸。
[0034]在本专利技术的一些实施方式中，所述氧化硫化酶突变体的氨基酸序列还可以是与SEQ ID NO.2
‑
6所示的氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列。
[0035]在本专利技术的一些具体实施方式中，所述氧化硫化酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示的其中一种氨基酸序列。
[0036]本专利技术的第二个方面，提供编码本专利技术第一个方面所述氧化硫化酶的突变体的核酸分子，所述核酸分子编码的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.8
‑
12所示的序列。
[0037]其中，编码野生型KsEanB的核酸分子的核苷酸序列为：
[0038]5’‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种氧化硫化酶的突变体，其特征在于，所述突变体为具有如SEQ ID NO.1所示的氧化硫化酶氨基酸序列经以下任一种氨基酸置换后的氨基酸序列：第86位氨基酸从V突变为S；第292位的氨基酸L突变为A；第348位氨基酸从T突变为K。2.根据权利要求1所述的氧化硫化酶的突变体，其特征在于，所述氧化硫化酶的突变体的氨基酸序列包括如下(1)
‑
(5)中的任意一种：(1)SEQ ID NO.2；(2)SEQ ID NO.3；(3)SEQ ID NO.4；(4)SEQ ID NO.5；(5)SEQ ID NO.6。3.编码权利要求1
‑
2中任一项所述氧化硫化酶的突变体的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.8
‑
12所示的序列。4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包括如权利要求3所述的核酸分子。5.一种重组宿主细胞，其特征在于，含有权利要求3所述的核酸分子和/或权利要求4所述的重组载体...

【专利技术属性】
技术研发人员：李钊，刘立辉，
申请(专利权)人：深圳希吉亚生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：