烟酰胺核糖激酶及其应用制造技术

本申请公开了烟酰胺核糖激酶及其应用。该烟酰胺核糖激酶包括：(a)如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或(b)由(a)所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸，但烟酰胺核糖激酶活性不变的氨基酸序列。根据本申请实施例的烟酰胺核糖激酶，至少具有如下有益效果：与现有烟酰胺核糖激酶相比，本申请实施例所提供的烟酰胺核糖激酶具有更好的热稳定性。这种高热稳定性使得酶在纯化时可以通过简单的加热处理后就可以使用而无需进行复杂且昂贵的柱纯化。因此，可以大幅降低生产成本，适用于大规模工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
烟酰胺核糖激酶及其应用
本申请涉及酶工程
，尤其是涉及烟酰胺核糖激酶及其应用。
技术介绍
烟酰胺单核苷酸(Nicotinamidemononucleotide，NMN)是烟酰胺核糖激酶与烟酰胺核糖等反应的产物，同时是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamideadeninedinucleotide，NAD+)的关键前体之一。NMN在人体内通过转化为NAD+来发挥其生理功能，如激活NAD+底物依赖性酶Sirt1(组蛋白脱乙酰酶，又称沉默调节蛋白)、调节细胞存活和死亡、维持氧化还原状态等。由于NAD+分子量过大，无法通过口服摄取至细胞内，主要依赖于体内细胞的合成，而且合成量很低。但随着对NAD+前体小分子物NMN的研究发现，食用NMN可以有效提升体内NAD+的含量，对心脑血管疾病、神经退行性病及老化退行性疾病等有较好的治疗和修复作用；另外，NMN还可通过参与和调节机体的内分泌，起到保护和修复胰岛功能，增加胰岛素的分泌，防治糖尿病和肥胖等代谢性疾病的作用。随着对NMN的药用和保健作用研究的增加，对NMN的市场需求日益增长。目前NMN在欧、美、日等发达国家已批准作为保健食品原料，并以NMN为主要成份开发出多种保健品，如美国HERBALmax、基因港GeneHarborNMN9000、日本MIRAILABNMN3000胶囊、澳大利亚synext等。NMN的体外制备方法目前以化学合成为主，比如，2002年，Tanimori等人用乙酰基保护的核糖与烟酰胺在三甲硅基三氟甲磺酸脂(TMSOTf)的催化下发生缩合反应；又比如2004年Palmarisa等人使用硅烷化试剂对烟酰胺进行硅烷化，然后与乙酰核糖在TMSOTf的催化下进行反应。这些化学合成方法存在杂质过多，分离纯化极其困难，成本高、收率低而且化学试剂污染严重等问题。因此，生物转化制备NMN已经成为各大医药公司竞争的研究热点。以烟酰胺核糖激酶(NRK)催化转化包含烟酰胺核糖和ATP的底物为NMN是一种绿色环保的生物催化方法。然而，现有报道的烟酰胺核糖激酶的热稳定性普遍较差，例如酵母来源的烟酰胺核糖激酶最适反应温度只有30℃，人源粗烟酰胺核糖激酶的最适反应温度也只有37℃。热稳定性较差也进一步导致这些酶在反应前只有通过柱纯化的方式才能除去杂酶减少副反应，成本过高，无法满足工业化生产的要求。
技术实现思路
本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种热稳定性较高的烟酰胺核糖激酶及其应用。本申请的第一方面，提供烟酰胺核糖激酶，该烟酰胺核糖激酶包括：(a)如SEQIDNo.1所示的氨基酸序列；或(b)由(a)所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸，但烟酰胺核糖激酶活性不变的氨基酸序列。根据本申请实施例的烟酰胺核糖激酶，至少具有如下有益效果：与现有烟酰胺核糖激酶相比，本申请实施例所提供的烟酰胺核糖激酶具有更好的热稳定性。这种高热稳定性使得酶在纯化时可以通过简单的加热处理后就可以使用而无需进行复杂且昂贵的柱纯化。因此，可以大幅降低生产成本，适用于大规模工业化生产。本申请的第二方面，提供分离的多核苷酸，该多核苷酸包括：(A1)编码上述烟酰胺核糖激酶的核苷酸序列；或(A2)与(A1)的核苷酸序列互补的核苷酸序列。根据本申请的一些实施例，多核苷酸的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。本申请的第三方面，提供重组载体，该重组载体包括上述的多核苷酸。根据本申请的一些实施例，所述重组载体为pET、pCW、pUC、pPIC9k中的任一种。本申请的第四方面，提供宿主细胞，该宿主细胞包括上述重组载体，或上述多核苷酸。根据本申请的一些实施例，该宿主细胞选自大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、链霉菌、枯草芽孢杆菌等本领域熟知的能够用于表达目的的蛋白的真核或原核细胞。本申请的第五方面，提供烟酰胺核糖激酶的生产方法，该生产方法包括以下步骤：培养上述的宿主细胞，获得培养物，从培养物中分离出烟酰胺核糖激酶。根据本申请的一些实施例，在分离出烟酰胺核糖激酶的粗酶液后，可以按照下述纯化方法对其进行进一步的纯化以获得更高纯度的烟酰胺核糖激酶。本申请的第六方面，提供烟酰胺核糖激酶的纯化方法，该纯化方法包括以下步骤：对粗酶液进行热处理，所述粗酶液包括上述烟酰胺核糖激酶。根据本申请的一些实施例，热处理的温度可以是30～80℃，处理时间在50min以下。根据本申请的一些实施例，热处理温度在35～75℃、40～70℃、45～65℃、50～60℃。根据本申请的一些实施例，热处理时间在2～45min、2～40min、2～35min、2～30min、2～25min、2～20min、5～20min、2～15min、5～15min、2～10min、5～10min中的任一种。本申请的第七方面，提供烟酰胺单核苷酸的生产方法，该生产方法包括以下步骤：将底物与上述的烟酰胺核糖激酶、或上述的宿主细胞、或上述宿主细胞的培养物接触，底物包括烟酰胺核糖和ATP。根据本申请的一些实施例，烟酰胺核糖激酶为酶溶液或酶冻干粉。根据本申请的一些实施例，该生产方法包括以下步骤：(1)将底物与上述烟酰胺核糖激酶混合，在40～80℃、pH为5.0～6.0的条件下反应；(2)获得含烟酰胺单核苷酸的粗酶液，经分离纯化得到烟酰胺单核苷酸。本申请的第八方面，提供上述烟酰胺核糖激酶，或上述多核苷酸，或上述重组载体，或上述宿主细胞在制备烟酰胺单核苷酸中的应用。本申请的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。附图说明图1是本申请的一个实施例的催化反应终产物的核磁共振氢谱结果。具体实施方式以下将结合实施例对本申请的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本申请的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本申请的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本申请的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本申请保护的范围。下面详细描述本申请的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。在本申请的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。本申请的描述中，除非另有明确的限定，设置、安装、连接等词语应做广义理解，所属
技术人员可以结合技术方案的具体内容合理确定上述词语在本申请中的具体含义。本申请的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.烟酰胺核糖激酶，其特征在于，包括：/n(a)如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或/n(b)由(a)所示的所述氨基酸序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸，但烟酰胺核糖激酶活性不变的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.烟酰胺核糖激酶，其特征在于，包括：
(a)如SEQIDNo.1所示的氨基酸序列；或
(b)由(a)所示的所述氨基酸序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸，但烟酰胺核糖激酶活性不变的氨基酸序列。


2.分离的多核苷酸，其特征在于，包括：
(A1)编码权利要求1所述的烟酰胺核糖激酶的核苷酸序列；或
(A2)与(A1)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。


3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。


4.重组载体，其特征在于，包括权利要求2至3任一项所述的多核苷酸。


5.宿主细胞，其特征在于，包括权利要求4所述重组载体，或包括权利要求2至3任一项所述的多核苷酸。


6.烟酰胺核糖激酶的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：培养权利要求5所述的宿主细胞，获得培养物，从所述培养物...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖春英，
申请(专利权)人：深圳希吉亚生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44