一种鼠李糖苷酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种鼠李糖苷酶突变体及其应用。所述突变体包括如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列在第187位、第337位和第521位中的至少一个氨基酸处的突变。与现有技术中的鼠李糖苷酶相比，具有更优良的热稳定性以及更高的催化效率，突变体最适反应温度为80℃，相比野生酶提高了10度；在70℃保温6小时后活性仍没有检测到活性下降，且在70℃下测定的半衰期达10h，稳定性高。以120g/l朝藿定C为底物，在80℃、pH 8.0的条件下反应4h后，淫羊藿苷浓度达到118g/L，转化效率可达98.3％。该方法制备淫羊藿苷操作简单，成本低廉，可适用于大规模工业化生产，更具有市场竞争力。更具有市场竞争力。

【技术实现步骤摘要】
一种鼠李糖苷酶突变体及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种鼠李糖苷酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]α
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鼠李糖苷酶(α
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rhamnosidase，EC 3.2.1.40)是一种能特异性地水解鼠李糖苷键的水解酶，广泛存在于动物、植物和微生物中。目前己报道大多数α
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鼠李糖苷酶来源于微生物，其中，己表征的细菌源GH78家族α
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鼠李糖苷酶有19个，大多数来源于革兰氏阳性细菌，包括芽孢杆菌属、乳酸杆菌属、梭菌属、链霉菌属和热微菌门属。
[0003]多数从植物中提取的糖苷类黄酮化合物都含有一个或者多个鼠李糖基，例如芦丁、橘皮苷、柚皮苷、新橙皮苷以及朝藿定C等。该系列黄酮化合物中，鼠李糖基的存在很大程度上影响了它们的溶解性以及生物活性。因此，利用α
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鼠李糖苷酶，将其中的鼠李糖基水解不仅能够极大改善溶解性，提高人体对黄酮类化合物的吸收率，更能够提高黄酮化合物的生物利用率。α
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鼠李糖苷酶已被广泛地应用在食品、医药等领域。食品工业中能应用于柑桔类果汁的去苦，饮料风味改善以及食品添加剂的生产等。在医药领域中，用于生产药物或者药物中间体以及对药物进行改性提高药效等。由于该酶具有良好的应用前景，因此吸引了国内外越来越多的研究者对其进行研究开发。
[0004]淫羊藿苷是一种具有8
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异戊烯基黄酮母核的黄酮类物质，CAS号为489
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7，已被证实在防治肝癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌等方面的生物活性显著高于朝藿定C等其它多组分类黄酮类化合物。然而天然环境中，在淫羊藿草中淫羊藿苷的比例一般在2％以下，相对而言，朝藿定C的含量会比淫羊藿苷更丰富，通常是淫羊藿苷含量的5～6倍。与淫羊藿苷结构相比，朝藿定C在3位多一个α
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1,2糖苷键连接鼠李糖，如果能将朝藿定C的3位上鼠李糖特异性切除，就可以将朝藿定C转化成淫羊藿苷。由此可见，筛选获得能特异性降解鼠李糖连接的α
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1,2糖苷键的α
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鼠李糖苷酶，研究淫羊藿苷的生物催化制备工艺，对其大规模工业生产具有重要意义。
[0005]酶法水解具有温和、高效、专一等特点，适合用于糖苷类黄酮化合物的水解，但现有的α
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鼠李糖苷酶酶催化朝藿定C制备淫羊藿苷的转化浓度与效率离工业化生产还有一定的距离。如专利申请CN201810110773中，使用来源于多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)的鼠李糖苷酶，4h内水解1g/L的朝藿定C，摩尔转化率达90.5％。专利申请CN201910435031公开了重组AnRhaE全细胞催化水解1g/L淫羊藿提取物样品，于37℃进行催化反应1.5h可将朝藿定C完全转化为淫羊藿苷。专利申请CN202010928885将来源于Aspergillus nidulans FGSC A4菌株的α
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鼠李糖苷酶RhaE在毕赤酵母细胞中进行表达获得重组酶，50℃下反应2h，水解2g/L朝藿定C生成淫羊藿苷。专利申请CN 202111434208利用重组AmRhaE粗酶液催化水解淫羊藿提取物样品，催化水解4g/L朝藿定C，反应24h，转化率为97％。已报道的文献中转化浓度最高的是专利申请CN202111511848，公开了一种碱性嗜热鼠李糖苷酶，在80℃水浴转化100g/L朝藿定C，反应6h，转化率>98.5％。因此，挖掘更多能够高效催化朝藿定C生成淫羊藿苷的α
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鼠李糖苷酶，以指导工业化的大规模生产淫羊藿
苷具有重要价值。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种新来源的鼠李糖苷酶，并利用定点突变对其进行定向改造，提高其在催化生产淫羊藿苷中的热稳定性及催化效率。
[0007]本专利技术所采取的技术方案是：
[0008]本专利技术的第一方面，提供一种鼠李糖苷酶突变体，所述突变体包括如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列在第187位、第337位和第521位中的至少一个氨基酸处的突变。
[0009]优选地，所述如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列在第187位突变为异亮氨酸；所述如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列在第337位突变为丙氨酸；所述如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列在第521位突变为丝氨酸。
[0010]优选地，所述鼠李糖苷酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.6任一项所示。
[0011]优选地，所述鼠李糖苷酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0012]本专利技术的第二方面，提供一种核酸分子，所述核酸分子的核苷酸序列为：
[0013](I)编码本专利技术第一方面所述的鼠李糖苷酶突变体；或
[0014](II)与(I)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
[0015]优选地，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.8～SEQ ID NO.12所示。
[0016]本专利技术的第三方面，提供一种重组载体，所述载体可表达本专利技术第一方面所述的鼠李糖苷酶或含有本专利技术第二方面所述的核酸分子。
[0017]优选地，所述载体包括所述载体包括pET、pCW、pUC或pPIC9k。
[0018]本专利技术的第四方面，提供一种重组细胞，所述重组细胞包含本专利技术第三方面所述的重组载体。所述重组细胞非动物或植物新品种。
[0019]优选地，所述重组细胞选自大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、链霉菌、枯草芽孢杆菌等本领域熟知的能够用于表达目的蛋白的真核或原核细胞。
[0020]优选地，所述大肠杆菌包括E.coli BL21(DE3)或E.coli DH5α。
[0021]本专利技术的第五方面，提供本专利技术第一方面所述的鼠李糖苷酶突变体、本专利技术第二方面所述核酸分子、本专利技术第三方面所述重组载体、本专利技术第四方面所述重组细胞在以下至少一项中的应用：
[0022](a)水解鼠李糖苷键中的应用；
[0023](b)制备水解鼠李糖苷键的产品；
[0024](c)生产淫羊藿苷；
[0025](d)制备生产淫羊藿苷的产品。
[0026]优选地，所述鼠李糖苷键包括朝藿定C鼠李糖苷键、芦丁鼠李糖苷键、柚皮苷鼠李糖苷键、杨梅苷鼠李糖苷键、新橙皮苷鼠李糖苷键、柴胡皂苷C鼠李糖苷键、橙皮苷、芦鼠李糖苷键、槲皮苷鼠李糖苷键、薯蓣皂苷鼠李糖苷键中的至少一种。
[0027]本专利技术第六方面，提供一种鼠李糖苷酶突变体的制备方法，通过培养本专利技术第四方面所述的重本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鼠李糖苷酶突变体，其特征在于：所述突变体包括如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列在第187位、第337位和第521位中的至少一个氨基酸处的突变。2.根据权利要求1所述的鼠李糖苷酶突变体，其特征在于，所述如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列在第187位突变为异亮氨酸；所述如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列在第337位突变为丙氨酸；所述如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列在第521位突变为丝氨酸。3.根据权利要求2所述的鼠李糖苷酶突变体，其特征在于，所述鼠李糖苷酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.6任一项所示；优选地，所述鼠李糖苷酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含：(I)编码权利要求1～3任一项所述的鼠李糖苷酶突变体的核苷酸序列；或(II)与(I)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列；优选地，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.8～SEQ ID NO.12任一项所示。5.一种重组载体，其特征在于，所述载体可表达权利要求1～3任一项所述的鼠李糖苷酶或含有权利要求4所述的核酸分子。6.一种重组细胞，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：李钊，刘立辉，
申请(专利权)人：深圳希吉亚生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：