烟酰胺单核苷酸的酶促合成方法技术

本发明专利技术公开了烟酰胺单核苷酸的酶促合成方法。该酶促合成方法包括以下步骤：S1：以核糖‑5‑磷酸、胞苷酸、多聚磷酸盐、烟酰胺为原料，在磷酸核糖焦磷酸化酶、多聚磷酸激酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶催化作用下，生成烟酰胺单核苷酸。申请人以多聚磷酸激酶催化胞苷酸利用多聚磷酸盐所提供的磷酸基团来循环得到胞苷三磷酸，并作为磷酸核糖焦磷酸化酶的焦磷酸供体，推动核糖‑5磷酸和烟酰胺的酶促反应的进行，从而避免了使用价格昂贵的ATP。此外，本申请所提供的酶促反应过程中的胞苷酸和胞苷三磷酸在酸性条件下几乎不溶于水，因此，反应结束后可以直接通过调节pH的方法快速简便地去除产物中的杂质，简化了纯化过程，降低了分离纯化的难度。

【技术实现步骤摘要】
烟酰胺单核苷酸的酶促合成方法
本申请涉及生物化工
，尤其是涉及烟酰胺单核苷酸的酶促合成方法。
技术介绍
烟酰胺单核苷酸(Nicotinamidemononucleotide，NMN)是烟酰胺核糖激酶与烟酰胺核糖等反应的产物，同时是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamideadeninedinucleotide，NAD+)的关键前体之一。NMN在人体内通过转化为NAD+来发挥其生理功能，如激活NAD+底物依赖性酶Sirt1(组蛋白脱乙酰酶，又称沉默调节蛋白)、调节细胞存活和死亡、维持氧化还原状态等。然而，NAD+分子量过大，无法通过口服摄取至细胞内，仅仅依赖于体内细胞的微量合成很难满足特定目标人群的需求。但随着对NMN的进一步研究发现，食用NMN可以有效提升体内NAD+的含量，对心脑血管疾病、神经退行性病及老化退行性疾病等有较好的治疗和修复作用；另外，NMN还可通过参与和调节机体的内分泌，起到保护和修复胰岛功能，增加胰岛素的分泌，防治糖尿病和肥胖等代谢性疾病的作用。随着对NMN的药用和保健作用研究的增加，对NMN的市场需求日益增长。目前，NMN的体外制备方法，以化学合成为主，例如，Tanimori等人用乙酰基保护的核糖与烟酰胺在三甲硅基三氟甲磺酸脂(TMSOTf)的催化下发生缩合反应；而Palmarisa等人使用硅烷化试剂对烟酰胺进行硅烷化，然后与乙酰核糖在TMSOTf的催化下进行反应；这些化学合成方法制备得到的产品中杂质过多，分离纯化极其困难，存在成本高、收率低而且化学试剂污染严重等问题。因此，生物酶法制备NMN已经成为各大医药公司竞争的研究热点。酶法生产NMN是一种绿色环保的生物催化方法，现有报道的酶法生产NMN的工艺中大多使用ATP作为反应原料，然而，一方面，ATP的价格昂贵导致原料成本过高，不利于酶法生产NMN的工业化；另一方面，酶促反应结束后，产物与原料的分离难度较高。
技术实现思路
本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种分离纯化难度较低、成本低廉的烟酰胺单核苷酸的酶促合成方法。本申请的第一方面，提供烟酰胺单核苷酸的酶促合成方法，该酶促合成方法包括以下步骤：S1：以核糖-5-磷酸、胞苷酸、多聚磷酸盐、烟酰胺为原料，在磷酸核糖焦磷酸化酶、多聚磷酸激酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶催化作用下，生成烟酰胺单核苷酸。根据本申请实施例的酶促合成方法，至少具有如下有益效果：申请人以多聚磷酸激酶催化胞苷酸利用多聚磷酸盐所提供的磷酸基团来循环得到胞苷三磷酸，并作为磷酸核糖焦磷酸化酶的焦磷酸供体，推动核糖-5磷酸和烟酰胺的酶促反应的进行，从而避免了使用价格昂贵的ATP。此外，相比于AMP和ATP，本申请所提供的酶促反应过程中的胞苷酸和胞苷三磷酸在酸性条件下几乎不溶于水，因此，可以在反应结束后直接通过调节pH的方法快速简便地去除产物中的杂质，简化了纯化过程，降低了分离纯化的难度。其中，多聚磷酸盐是指由三个以上磷酸基团组成的无机盐或其混合物，其中至少部分或全部磷酸基团之间以磷酸酐键相连，多聚磷酸盐的非限制性实例包括低聚磷酸盐(如三聚磷酸盐、四聚磷酸盐、六偏磷酸盐)等，具体可以是多聚磷酸的碱金属盐，如钠盐、钾盐等。磷酸核糖焦磷酸化酶(rpPk)是指能够在磷酸供体存在的条件下，使核糖-5-磷酸焦磷酸化、得到核糖-5-磷酸-1-焦磷酸(PRPP)的酶。本申请所提供的酶促合成反应中使用的rpPK可以是本领域所知晓的任一种野生型rpPK，或者对野生型PPK进行突变获得的酶活不发生下调的突变型rpPK。多聚磷酸激酶(PolyphospateKinase，PPK)是指能够催化胞苷酸的磷酸化，进而得到胞苷三磷酸的酶。具体而言，在本方案中，多聚磷酸激酶利用多聚磷酸盐(如三聚磷酸盐、四聚磷酸盐、六偏磷酸盐)完成胞苷酸到胞苷酸磷酸的循环。多聚磷酸激酶在细菌等微生物中广泛存在，包括铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、福氏志贺菌(Shigellaflexneri)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、红色亚栖热菌(Meiothermusruber)等。因此，本申请所提供的酶促合成反应中使用的PPK可以是本领域所知晓的任一种野生型PPK，或者对野生型PPK进行突变获得的酶活不发生下调的突变型PPK。烟酰胺磷酸核糖转移酶(NicotinamidePhosphoribosyltransferase，NAMPT)是指能够催化烟酰胺与核糖-5-磷酸-1焦磷酸缩合产生烟酰胺单核苷酸的酶。烟酰胺磷酸核糖转移酶在动物和细菌等多种生物体内均有发现，包括人(Homosapiens)、小鼠(Musmusculus)、褐家鼠(Rattusnorvegicus)、奥奈达希瓦氏菌(Shewanellaoneidensis)、杜克雷氏嗜血杆菌(Haemophilusducreyi)、红色亚栖热菌(Meiothermusruber)等。因此，本申请所提供的酶促合成方法中使用的NAMPT可以是本领域所知晓的任一种野生型NAMPT。另外，野生型NAMPT的酶活普遍较低，因此，本申请中的NAMPT同样可以是对野生型NAMPT的一个或多个位点进行突变后所获得的酶活提高的突变型NAMPT。因此，在本申请的酶促合成过程中，磷酸核糖焦磷酸化酶、多聚磷酸激酶、烟酰胺磷酸核糖转移酶等酶可以是从细胞纯化得到、或通过重组手段由重组工程菌表达得到，以粗酶液或干粉的形式参与酶促反应。另外，也可以进一步通过物理或化学方法固定到固相载体(如包埋柱、微珠等)上参与酶促反应。在本申请的一些实施方式中，磷酸核糖焦磷酸化酶来源于火球菌(Pyrococcushorikoshii)。在本申请的一些实施方式中，磷酸核糖焦磷酸化酶的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。在本申请的一些实施方式中，多聚磷酸激酶来源于红色亚栖热菌(Meiothermusruber)。在本申请的一些实施方式中，多聚磷酸激酶的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。在本申请的一些实施方式中，烟酰胺磷酸核糖转移酶来源于杜克雷氏嗜血杆菌(Haemophilusducreyi)。在不同来源的野生型的NAMPT中，来源于H.ducreyi的NAMPT具有较高的酶活，因此，为提高NMN的产率，优选使用来源于H.ducreyi的NAMPT。在本申请的一些实施方式中，烟酰胺磷酸核糖转移酶的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。在本申请的一些实施方式中，磷酸核糖焦磷酸化酶、多聚磷酸激酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶的酶活力比例为(2-3)：(2-3)：1。在本申请的一些实施方式中，S1前还包括S0：以胞苷酸为原料，在胞苷酸水解酶催化作用下，生成核糖-5-磷酸。为进一步降低原料成本，核糖-5-磷酸进一步由成本较低的胞苷酸通过水解得到。其中，胞苷酸水解酶(phNn)是指能够将胞苷酸水解生成核糖-5-磷酸和胞嘧啶的酶。本申请所提供的酶促合成反应中使用的phNn可以是本领域所知晓的任一种野生型ph本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.烟酰胺单核苷酸的酶促合成方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1：以核糖-5-磷酸、胞苷酸、多聚磷酸盐、烟酰胺为原料，在磷酸核糖焦磷酸化酶、多聚磷酸激酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶催化作用下，生成烟酰胺单核苷酸；/n优选的，所述磷酸核糖焦磷酸化酶来源于火球菌(Pyrococcus horikoshii)；/n优选的，所述磷酸核糖焦磷酸化酶的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；/n优选的，所述多聚磷酸激酶来源于红色亚栖热菌(Meiothermus ruber)；/n优选的，所述多聚磷酸激酶的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；/n优选的，所述烟酰胺磷酸核糖转移酶来源于杜克雷氏嗜血杆菌(Haemophilusducreyi)；/n优选的，所述烟酰胺磷酸核糖转移酶的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。/n

【技术特征摘要】
1.烟酰胺单核苷酸的酶促合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：以核糖-5-磷酸、胞苷酸、多聚磷酸盐、烟酰胺为原料，在磷酸核糖焦磷酸化酶、多聚磷酸激酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶催化作用下，生成烟酰胺单核苷酸；
优选的，所述磷酸核糖焦磷酸化酶来源于火球菌(Pyrococcushorikoshii)；
优选的，所述磷酸核糖焦磷酸化酶的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；
优选的，所述多聚磷酸激酶来源于红色亚栖热菌(Meiothermusruber)；
优选的，所述多聚磷酸激酶的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；
优选的，所述烟酰胺磷酸核糖转移酶来源于杜克雷氏嗜血杆菌(Haemophilusducreyi)；
优选的，所述烟酰胺磷酸核糖转移酶的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。


2.根据权利要求1所述的酶促合成方法，其特征在于，所述磷酸核糖焦磷酸化酶、所述多聚磷酸激酶和所述烟酰胺磷酸核糖转移酶的酶活力比例为(2-3)：(2-3)：1。


3.根据权利要求1或2所述的酶促合成方法，其特征在于，S1前还包括S0：以胞苷酸为原料，在胞苷酸水解酶催化作用下，生成所述核糖-5-磷酸；
优选的，所述胞苷酸水解酶来源于宋内志贺菌(Shigellasonnei)；
优选的，所述胞苷酸水解酶的核苷酸序列如SEQIDNo...

【专利技术属性】
技术研发人员：李钊，
申请(专利权)人：深圳希吉亚生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44