一种基于酶法合成烟酰胺单核苷酸的方法技术

本发明专利技术提供了一种基于酶法合成烟酰胺单核苷酸(NMN)的方法，其以D‑核糖、烟酰胺、ATP为底物，在核糖激酶、磷酸核糖变位酶及烟酰胺核糖激酶的偶联催化作用下，一锅法合成得到烟酰胺单核苷酸。本发明专利技术制备NMN的方法开辟了一条酶法合成NMN的新途径。本发明专利技术中的三种酶可以循环利用、成本低、节能环保，适用于规模化工业生产。

【技术实现步骤摘要】
一种基于酶法合成烟酰胺单核苷酸的方法
本专利技术属于生物制药和生物催化
，涉及一种基于酶法合成烟酰胺单核苷酸的新方法。
技术介绍
烟酰胺单核苷酸(β-Nicotinamidemononucleotide，简称β-NMN或者NMN)是烟酰胺磷酸核糖转移酶反应的产物，是NAD+的关键前体，其在被烟酰胺核苷酸腺苷转移酶腺苷化后变成NAD+。人体细胞外NMN需要去磷酸转化为烟酰胺核糖(NR)才能进入肝细胞内部，随后NR在烟酰胺核苷激酶1的作用下生成NMN。NMN在人体内通过转化为NAD+来发挥其生理功能，如激活NAD+底物依赖性酶Sirt1(组蛋白脱乙酰酶，又称沉默调节蛋白)、调节细胞存活和死亡、维持氧化还原状态等。近期研究发现，通过补充NMN可以明显提高体内的NAD+水平，对心脑血管疾病、神经退行性病及老化退行性疾病等有较好的治疗和修复作用，还可以调节内分泌，起到保护和修复胰岛功能，增加胰岛素的分泌，对糖尿病和肥胖等代谢性疾病具有预防作用。目前NMN的合成方法包括化学法和酶法。人们试图通过化学法来生产NMN，该方法通常是以烟酰胺核糖(NR)为原料，用三氯氧磷等进行磷酸化得到(Chem.Commun.1999,729-730，CN107613990A)，但所获产品杂质多、收率低、成本高，且涉及大量有毒有害试剂的使用，造成严重的环境污染，限制了其在食品级NMN的生产应用。现以酶法生产NMN成为了当前NMN生产的主流方式。例如，CN108026130A和CN110195089A公开了以烟酰胺、ATP和核糖为原料，在烟酰胺磷酸核糖转移酶、核糖磷酸焦磷酸激酶以及核糖激酶的催化作用下发生反应，制备烟酰胺单核苷酸；CN108949865A公开了以D-核糖-5-磷酸、ATP和烟酰胺为原料，通过固定化含有磷酸核糖焦磷酸合成酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶的全细胞催化合成烟酰胺单核苷酸。CN106755209A公开了以烟酰胺核糖、ATP为底物，在烟酰胺核糖激酶的催化下生成烟酰胺单核苷酸；CN108026535A公开了以烟酰胺、ATP和AMP为原料，在烟酰胺磷酸核糖转移酶、核糖磷酸焦磷酸激酶以及核苷酶的催化作用下发生反应，制备烟酰胺单核苷酸。PCT/CN2016/092457专利技术公开了一种制备烟酰胺单核苷酸的方法，以烟酰胺、ATP和木糖为原料，在烟酰胺磷酸核糖转移酶、核糖磷酸焦磷酸激酶、核糖-5-磷酸异构酶、核酮糖-3-磷酸异构酶、木酮糖激酶以及木糖异构酶的催化作用下发生反应，合成烟酰胺单核苷酸。上述专利文献用到的原料中，烟酰胺核糖暂无酶法直接制备的方法，需化学法合成，价格昂贵且不易购买，D-核糖-5-磷酸性质不稳定，价格也昂贵；而以廉价D-核糖为原料的专利中，需经核糖激酶、烟酰胺磷酸核糖转移酶和核糖磷酸焦磷酸激酶等多步反应合成NMN，转化率低(50％左右)、纯化困难、成本高；本专利技术首次揭示了磷酸核糖激酶的双层功能，即对核糖-1-磷酸具有解磷酸作用和对烟酰胺核糖具有磷酸化作用，在该酶的上述作用下，可以将核糖-1-磷酸、烟酰胺和ATP一步合成NMN，进而有了本专利技术的全新NMN合成路线，即以D-核糖、烟酰胺、ATP为底物，在核糖激酶、磷酸核糖变位酶及烟酰胺核糖激酶的偶联催化作用下，一锅法合成得到烟酰胺单核苷酸，该方法转化率高(大于90％)、收率高(大于80％)、成本低，适用于大规模化工业生产。
技术实现思路
鉴于烟酰胺核糖暂无酶法直接制备的相关报道，本专利技术的目的在于提供一种从廉价原料D-核糖出发，利用酶法先从D-核糖合成烟酰胺核糖，再合成烟酰胺单核苷酸，开发了一条酶法合成NMN的新途径，具体地是利用烟酰胺核糖激酶对核糖-1-磷酸的解磷酸和对烟酰胺核糖的磷酸化双层功能制备NMN。其具体反应过程如下：D-核糖在核糖激酶的作用下合成核糖-5-磷酸；核糖-5-磷酸在磷酸核糖变位酶的作用下变为核糖-1-磷酸；核糖-1-磷酸在烟酰胺核糖激酶的解磷酸作用下合成烟酰胺核糖；烟酰胺核糖在烟酰胺核糖激酶的磷酸化作用下合成烟酰胺单核苷酸。本专利技术提供以下技术方案。一种基于酶法合成烟酰胺单核苷酸的方法，包括如下步骤：以D-核糖、烟酰胺、ATP为底物，在核糖激酶、磷酸核糖变位酶及烟酰胺核糖激酶的偶联催化作用下，一锅法合成得到烟酰胺单核苷酸，其工艺路线如图1所示。上述反应体系中，D-核糖浓度为20-120mM，优选50-100mM，进一步优选50mM；烟酰胺浓度为20-120mM，优选50-100mM，进一步优选50mM；ATP浓度为20-150mM，优选60-120mM，进一步优选60mM。上述反应体系的反应温度为20-37℃，优选25-30℃，进一步优选25℃；反应体系的pH为4.5-7.0，优选5.0-6.0，进一步优选5.0；反应时间3-8h，优选4-6h，进一步优选4h。上述的方法，反应体系的缓冲液为磷酸盐缓冲液或Tris-Hcl缓冲液，优选磷酸盐缓冲液，其浓度为20-200mM，优选50-100mM，进一步优选50mM。上述的方法，向反应体系中添加Mg2+和Mn2+离子，反应中的Mg2+浓度为10-50mM，优选20-40mM，进一步优选20mM；反应中的Mn2+浓度为1-20mM，优选5-10mM,进一步优选5mM。上述的方法，所述的核糖激酶来源为酿酒酵母、植物乳杆菌和大肠杆菌中的至少一种，优选酿酒酵母；磷酸核糖变位酶来源为酿酒酵母、海栖热袍菌及大肠杆菌中的至少一种，优选海栖热袍菌；烟酰胺核糖激酶来源为人和酿酒酵母中的至少一种，优选人类来源。上述的方法，所述的酿酒酵母来源的核糖激酶氨基酸序列为SEQIDNO.1；海栖热袍菌来源的磷酸核糖变位酶氨基酸序列为SEQIDNO.2；人类来源的烟酰胺核糖激酶氨基酸序列为SEQIDNO.3。上述的方法，所述核糖激酶、磷酸核糖变位酶及烟酰胺核糖激酶的表达宿主为微生物。上述的方法，所述微生物包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母中的至少一种，优选大肠杆菌，进一步优选大肠杆菌BL21(DE3)；微生物中酶的重组表达载体为本领域常规的各种载体，包括：各种质粒、粘粒、噬菌体和病毒载体中的至少一种，优选原核表达载体pET30a(+)。上述的方法，所述核糖激酶、磷酸核糖变位酶及烟酰胺核糖激酶包括粗酶、纯化酶和固定化酶中的至少一种，优选固定化酶。本专利技术采用上述方法，优选将上述用酶的编码基因克隆至原核表达载体pET30a(+)，构建重组质粒，通过电转化导入大肠杆菌BL21(DE3)，按常规方法诱导表达。本专利技术优选上述用酶在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中生产后，经超声破碎，获得粗酶，进一步采用固定化金属螯合亲和层析(IMAC)纯化，获得纯化酶，粗酶和纯化酶均采用真空冷冻干燥制备成蛋白粉末；进一步采用环氧基载体ECEP进行固定化处理，获得固定化酶。上述反应体系中选用粗酶冻干粉时，三种酶用量:50mMD-核糖:核糖激酶粗酶冻干粉200-500mg:烟酰胺核糖激酶粗酶冻干粉200-500mg:磷酸核糖变位酶粗酶冻干粉400-800mg；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于酶法合成烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，以D-核糖、烟酰胺、ATP为底物，在核糖激酶、磷酸核糖变位酶及烟酰胺核糖激酶的偶联催化作用下，一锅法合成得到烟酰胺单核苷酸。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于酶法合成烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，以D-核糖、烟酰胺、ATP为底物，在核糖激酶、磷酸核糖变位酶及烟酰胺核糖激酶的偶联催化作用下，一锅法合成得到烟酰胺单核苷酸。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，反应体系中，所述的D-核糖浓度为20-120mM，优选50-100mM，进一步优选50mM；烟酰胺浓度为20-120mM，优选50-100mM，进一步优选50mM；ATP浓度为20-150mM，优选60-120mM，进一步优选60mM。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，反应体系的反应温度为20-37℃，优选25-30℃，进一步优选25℃；反应体系的pH为4.5-7.0，优选5.0-6.0，进一步优选5.0；反应时间3-8h，优选4-6h，进一步优选4h。


4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，反应体系的缓冲液为磷酸盐缓冲液或Tris-Hcl缓冲液，优选磷酸盐缓冲液，其浓度为20-200mM，优选50-100mM，进一步优选50mM。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，向反应体系中添加Mg2+和Mn2+离子，反应中的Mg2+浓度为10-50mM，优选20-40mM，进一步优选20mM；反应中的Mn2+浓度为1-20m...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵强，赵士敏，周晶辉，曾红宇，许岗，
申请(专利权)人：湖南福来格生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43