一种制备烟酰胺单核苷酸的方法技术

本发明专利技术提供了一种制备烟酰胺单核苷酸的方法，其以次黄苷酸和/或鸟苷酸、ATP和烟酰胺为原料，用核苷酶、核糖磷酸焦磷酸激酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶进行联合催化反应，一锅法合成得到烟酰胺单核苷酸。本发明专利技术的方法开辟了一条酶法合成烟酰胺单核苷酸的新途径，显著降低了生产成本。

【技术实现步骤摘要】
一种制备烟酰胺单核苷酸的方法
本专利技术属于生物催化
，涉及一种制备烟酰胺单核苷酸的方法，具体地说，涉及一种新的酶促合成烟酰胺单核苷酸的方法。
技术介绍
烟酰胺单核苷酸(β-Nicotinamidemononucleotide，简称β-NMN或者NMN)是人体中的一种内源性物质，是烟酰胺磷酸核糖转移酶反应的产物，参与细胞内烟酰胺嘌呤二核苷酸(NAD+)的合成，是其重要并且最直接的前提物质。在人体内，NMN通过转化为NAD+发挥其生理功能，如激活NAD+底物依赖性酶Sirt1(组蛋白脱乙酰酶，又称沉默调节蛋白)、调节细胞存活和死亡、维持氧化还原状态等。但它会随年龄增长而逐渐减少。由于NAD+分子量过大，很难被人体吸收，NAD+的补充只有通过摄取分子量较小的NMN等前体物质来实现。NMN也存在于日常饮食的多种蔬菜和水果中，但含量极其微量，摄入的量远远不足，所以需要额外补充。近年研究发现，人为补充NMN可以明显提高体内的NAD+水平，抑制衰老引起的认知能力下降，保护心脑血管功能，提升体能，延长寿命，还可以调节内分泌，防治糖尿病等代谢性疾病，保护视力和听力等。目前NMN的合成方法包括化学法和酶法。化学法工艺复杂，成本高，收率低，要用到有毒试剂，污染环境，限制了其应用。酶法正逐渐成为当前NMN生产的主流方式。例如，CN106755209A公开了以烟酰胺核糖，ATP为底物，在烟酰胺核糖激酶的催化下生成烟酰胺单核苷酸；CN108949865A公开了以D-5-磷酸核糖、ATP和烟酰胺为原料，通过固定化含有磷酸核糖焦磷酸合成酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶的全细胞催化合成烟酰胺单核苷酸。CN108026130A公开了以烟酰胺、ATP和核糖为原料，在烟酰胺磷酸核糖转移酶、核糖磷酸焦磷酸激酶以及核糖激酶的催化作用下发生反应，制得烟酰胺单核苷酸；CN108026535A公开了以烟酰胺、ATP和AMP为原料，在烟酰胺磷酸核糖转移酶、核酸磷酸焦磷酸激酶以及核苷酶的催化作用下发生反应，制得烟酰胺单核苷酸。但上述专利文献用到的原料中，D-5-磷酸核糖性质不稳定，价格昂贵；烟酰胺核糖也不是常用工业原料，不易购买，需要另行化学合成；AMP和ATP的价格较高。这些因素的存在不利于NMN高效环保的大规模生产。随着人们对NMN功能的深入了解，NMN的需求也呈现快速的增长，但高昂的价格也限制了其广泛应用，因此亟需开发高效、成本低廉的NMN合成工艺。
技术实现思路
为了克服现有技术的酶法制备NMN工艺的成本过高问题，专利技术人另辟蹊径，经反复实验，开发出一种全新的NMN酶法合成工艺，其原料成本更低，操作更简单，反应更彻底。具体而言，本专利技术包括如下技术方案。一种制备烟酰胺单核苷酸的方法，包括如下步骤：以次黄苷酸(IMP)和/或鸟苷酸(GMP)、ATP(三磷酸腺苷)、烟酰胺为原料，用核苷酶、核糖磷酸焦磷酸激酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶进行联合催化反应，得到烟酰胺单核苷酸。反应式如图1所示。上述的次黄苷酸和鸟苷酸可以是指次黄苷酸和鸟苷酸或者它们的钠盐。上述的核苷酶例如可以是AMP核苷酶或者IMP核苷酶。由于该方法是多种酶同时在一个反应体系中催化反应，因此属于“一锅法合成烟酰胺单核苷酸”，操作更简单。上述原料中，由于GMP(鸟苷酸)价格昂贵，出于降低生产成本考虑，优选地使用次黄苷酸(IMP)、或者次黄苷酸与GMP(鸟苷酸)的混合物。在一种优选的实施方式中，反应体系中还可以添加选自下组中的一种以上酶：嘌呤氧化酶、过氧化氢酶、无机焦磷酸酶。上述的嘌呤氧化酶例如可以是黄嘌呤氧化酶。通过在反应体系中添加嘌呤氧化酶、过氧化氢酶或者无机焦磷酸酶中的一种或多种，可以促进NMN的生成，可以显著加快反应速度，并提高转化率。优选地，上述核苷酶氨基酸序列NCBI登录号为WP_012699601.1；核糖磷酸焦磷酸激酶氨基酸序列NCBI登录号为A3MV85、BAA05286突变体N120S或者BAA05286突变体L135I；烟酰胺磷酸核糖转移酶氨基酸序列NCBI登录号为AAR87771、NP_717588或者WP_115638626；嘌呤氧化酶三个亚基的核苷酸序列NCBI登录号为947116、947205和945148；无机焦磷酸酶氨基酸序列NCBI登录号为Q58025。而过氧化物酶可以使用商品酶。上述反应体系中所用的酶可以呈游离酶、固定化酶或者其表达微生物菌体形式。所述的微生物可以是任何适合表达上述各酶的微生物，包括细菌和真菌。优选微生物是大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。作为上述各酶在微生物中的表达基因，核苷酶的表达基因的核苷酸序列可以为SEQIDNO:1；核糖磷酸焦磷酸激酶的表达基因的核苷酸序列可以为SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或者SEQIDNO:4；烟酰胺磷酸核糖转移酶的表达基因的核苷酸序列可以为SEQIDNO:5、SEQIDNO:6或者SEQIDNO:7；嘌呤氧化酶的表达基因的核苷酸序列可以为SEQIDNO:8；无机焦磷酸酶的表达基因的核苷酸序列可以为SEQIDNO:9。上述反应体系的反应温度为20-40℃，优选22-35℃，更优选25-30℃左右。上述反应体系的pH为7.0-8.0，优选pH7.2-7.8，更优选pH7.5左右。本专利技术的方法采用价格便宜的IMP或者IMP与GMP的混合物作为初始原料之一，相比直接采用AMP为原料，可以明显的降低成本。另外，作为初始原料之一的ATP，经过酶水解后可以产生AMP，又可以再次作为原料使用，显著降低了生产成本。而且，一锅法反应使得烟酰胺单核苷酸的合成反应操作更简单，原料转化更彻底，值得进一步开发利用。附图说明图1是本专利技术制备烟酰胺单核苷酸的方法的反应式。具体实施方式本专利技术提供了一种酶法合成烟酰胺单核苷酸的新途径，使用的原料IMP(次黄苷酸)、或者IMP与鸟苷酸(GMP)混合物、ATP和烟酰胺都是易购的商品，且相对廉价。采用一锅法反应简化了操作工艺。所使用的酶可以是商品化的核苷酶、核糖磷酸焦磷酸激酶、烟酰胺磷酸核糖转移酶、嘌呤氧化酶、过氧化氢酶、无机焦磷酸酶。当上述酶采用表达微生物菌体形式时，本领域技术人员很容易获得这些酶的编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。上述微生物包括细菌和真菌，比如可以是大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母等，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。为了在不同微生物中进行酶蛋白的最佳表达，可以针对特定的微生物比如大肠杆菌、毕赤酵母进行密码子优化。密码子优化是可用于通过增加感兴趣基因的翻译效率使生物体中蛋白质表达最大化的一种技术。不同的生物体由于突变倾向和天然选择而通常示出对于编码相同氨基酸的一些密码子之一的特殊偏好性。例如，在生长快速的微生物如大肠杆菌中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n以次黄苷酸和/或鸟苷酸、ATP、烟酰胺为原料，用核苷酶、核糖磷酸焦磷酸激酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶进行联合催化反应，得到烟酰胺单核苷酸。/n

【技术特征摘要】
1.一种制备烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
以次黄苷酸和/或鸟苷酸、ATP、烟酰胺为原料，用核苷酶、核糖磷酸焦磷酸激酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶进行联合催化反应，得到烟酰胺单核苷酸。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，原料使用次黄苷酸或者次黄苷酸与鸟苷酸的混合物。


3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，反应体系中还添加有选自下组中的一种以上酶：嘌呤氧化酶、过氧化氢酶、无机焦磷酸酶。


4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核苷酶氨基酸序列NCBI登录号为WP_012699601.1；核糖磷酸焦磷酸激酶氨基酸序列NCBI登录号为A3MV85、BAA05286突变体N120S或者BAA05286突变体L135I；烟酰胺磷酸核糖转移酶氨基酸序列NCBI登录号为AAR87771、NP_717588或者WP_115638626；嘌呤氧化酶三个亚基的核苷酸序列NCBI登录号为947116、947205和945148；无机焦磷酸酶氨基酸序列NCBI登录号...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶荣盛，原犇犇，朱傅赟，郑云，沈正权，孙梁栋，潘震华，沈青，胡海亮，刘萍，
申请(专利权)人：湖州颐盛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33