单胺氧化酶催化制备手性药物中间体的方法技术

本发明专利技术提供了一种酶催化制备式3所示(1R,2S,5S)

【技术实现步骤摘要】
单胺氧化酶催化制备手性药物中间体的方法


[0001]本专利技术属于生物催化
，具体地说，涉及一种利用单胺氧化酶催化制备手性药物中间体(1R,2S,5S)
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6,6
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二甲基
‑3‑
氮杂双环[3.1.0]己烷
‑2‑
磺酸钠的方法。

技术介绍

[0002]2021年12月，辉瑞公司的口服新冠药“Paxlovid”经FDA认证成为美国首个获批的口服抗新冠病毒药物。辉瑞Paxlovid由300mg(两片150mg片剂)的PF
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07321332和一片100mg的利托那韦片组成，每天给药2次，持续5天为一疗程。PF
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07321332为主要成分、且用量大。化合物(1R,2S,5S)
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6,6
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二甲基
‑3‑
氮杂双环[3.1.0]己烷
‑2‑
磺酸钠是其合成的关键手性中间体，同时也是丙肝蛋白酶抑制剂博昔普韦(Boceprevir)的关键手性中间体。
[0003][0004]文献(J.Am.Chem.Soc.2012,134,6467
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6472)公开了利用来自黑曲霉(Aspergillusniger)的单胺氧化酶(MAON)的氧化反应，并在亚硫酸氢钠存在下由6,6
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二甲基
‑3‑
氮杂双环[3.1.0]己烷出发制备出(1R,2S,5S)
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6,6
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二甲基
‑3‑
氮杂双环[3.1.0]己烷
‑2‑
磺酸钠。专利文献CN102131813A中也报道了的黑曲霉(Aspergillus niger)来源的单胺氧化酶(MAON) 及其多种突变体也具有该功能。

技术实现思路

[0005]专利技术人对于生物催化法制备(1R,2S,5S)
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6,6
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二甲基
‑3‑
氮杂双环[3.1.0]己烷
‑2‑
磺酸钠的工业化可行性进行了研究，发现所使用的单胺氧化酶(MAON)是本工艺的决定性因素，其酶活力和反应环境中稳定性是制约现有技术应用的限制性障碍。为了解决该技术问题，专利技术人对众多微生物来源的单胺氧化酶进行了筛选，通过实验比较，筛选出较为理想的单胺氧化酶，其催化6,6
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二甲基
‑3‑
氮杂双环[3.1.0]己烷转化为手性亚胺时具有反应底物/产物耐受性高、稳定性好、产品光学纯度高等优点。因此，本专利技术包括如下技术方案。
[0006]一种酶催化制备(1R,2S,5S)
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6,6
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二甲基
‑3‑
氮杂双环[3.1.0]己烷
‑2‑
磺酸钠的方法，包括如下步骤：
[0007]A.以式1所示的6,6
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二甲基
‑3‑
氮杂双环[3.1.0]己烷为底物，使用单胺氧化酶(MAON) SEQ ID NO:1或者其同源性≥80％、同源性≥85％、同源性≥90％、同源性≥95％的酶活力提高的突变体催化氧化反应，得到式2所示的(1R,5S)
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6,6
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二甲基
‑3‑
氮杂双环[3.1.0]己烷
‑2‑
烯；
[0008]B.使式2所示化合物与亚硫酸氢钠反应，得到式3所示(1R,2S,5S)
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6,6
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二甲基
‑3‑
氮杂双环[3.1.0]己烷
‑2‑
磺酸钠：
[0009][0010]其中单胺氧化酶SEQ ID NO:1来源于可可毛色二孢菌(Lasiodiplodia theobromae)， GenBank:XP_035363195.1，简写为maoN
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LT，氨基酸序列为：
[0011]MTSRDGYSWTEQTGLRPGVPSIGVITPVTNVVSSNVLYDVVVIGAGYCGLTAARDA SLSGLNVLLLEARDRIGGRSWSSNIGGYPFEMGGTWVHWGQPHVWREISRYQMQNELK NSFDFSYGVNHFQLNTTGGSSTMSHDEEDSLLASALEKFVNVDGASGRNIMPQPANMFY VPEARDLDSLSAQDRIDAIASSLSPSERAVLEGFVLLCSGGTLKGMSFLEFLHWWAICGY TYQGCLDYLITYKFSGGQSSFAINFFREALYTKRLSYAFNSPIQSVNDMGNKVEVTTRDG RTYQAARIICTVPLNVLSTVSFNPPLPDGKLAAIGVGHVNQCVKVHAEVSDKNMRSWT GVTYPSNKLIYAIGDGTTPAGNTHIVAFGSHQYHMQPEEKLDETFAAVKALAPGKMDVQ RLVFHNWSKDEFAKGAWFFSPPNLLADHLEDMRARHGNVFFASSDWALLWRSFIDGAIE EGARAAMAVKTELAETGKISPQL(SEQ ID NO:1)。
[0012]上述方法可以是一锅法进行酶
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化学组合反应。即，在一个反应器中由化合物1直接制备出化合物3，不进行化合物2的提取分离。
[0013]优选地，上述方法中，步骤A完成后，直接将亚硫酸氢钠加入到步骤A完成后的酶反应液中，进行步骤B的化学反应。其中，步骤B的化学反应是将亚硫酸氢钠溶液滴加/ 分批加入至酶反应液中，同时用氢氧化钠溶液控制pH保持在7.4左右。
[0014]可选地，上述方法中，在步骤A进行过程中，直接将亚硫酸氢钠加入到步骤A的酶反应液中，同步进行步骤A的酶促反应和步骤B的化学反应。
[0015]上述步骤A的反应体系中优选存在过氧化氢酶，并且通氧气或者加入过氧化氢：
[0016][0017]上述步骤A的反应体系中，所述单胺氧化酶SEQ ID NO:1或者其突变体呈酶形式或者表达微生物菌体形式。
[0018]在一种实施方式中，上述单胺氧化酶SEQ ID NO:1或者所述突变体可以为纯酶或者粗酶，可以为游离酶或者固定化酶。
[0019]可替代地，在反应体系中，所述单胺氧化酶SEQ ID NO:1或者所述突变体还可以呈其表达微生物菌体细胞形式。
[0020]当上述单胺氧化酶SEQ ID NO:1或者其突变体呈微生物菌体形式时，所述微生物优选是增殖速度快、适合于表达外源重组蛋白的微生物，例如选自枯草芽孢杆菌、短乳杆菌、大肠杆菌、木兰假丝酵母、毕赤酵母、酿酒酵母。优选微生物是大肠杆菌，更优选是大肠杆菌BL21(DE3)。
[0021]当单胺氧化酶SEQ ID NO:1通过大肠杆菌表达时，其编码基因的核苷酸序列可以为 SEQ ID NO:2。
[0022]优选地，步骤A的反应体系为缓冲液体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酶催化制备(1R,2S,5S)
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6,6
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二甲基
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氮杂双环[3.1.0]己烷
‑2‑
磺酸钠的方法，包括如下步骤：A.以式1所示的6,6
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二甲基
‑3‑
氮杂双环[3.1.0]己烷为底物，使用单胺氧化酶SEQ ID NO:1或者其同源性≥80％的酶活力提高的突变体催化氧化反应，得到式2所示的(1R,5S)
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6,6
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二甲基
‑3‑
氮杂双环[3.1.0]己烷
‑2‑
烯；B.使式2所示化合物与亚硫酸氢钠反应，得到式3所示(1R,2S,5S)
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6,6
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二甲基
‑3‑
氮杂双环[3.1.0]己烷
‑2‑
磺酸钠：2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，一锅法进行酶
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化学组合反应。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤A完...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶荣盛，朱傅赟，原犇犇，潘震华，沈正权，沈青，郑云，孙梁栋，刘萍，胡海亮，
申请(专利权)人：湖州颐盛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：