一种烟酰胺核糖激酶及烟酰胺单核苷酸的合成方法技术

本发明专利技术属于烟酰胺核糖激酶合成领域，涉及一种烟酰胺核糖激酶及烟酰胺单核苷酸的合成方法。所述烟酰胺核糖激酶的合成方法包括将烟酰胺核糖激酶生产菌株依次进行菌株活化、种子扩大培养和发酵培养，且在发酵培养过程中，分阶段将OUR、发酵液中ORP和乙酸浓度中的至少一者控制在预定范围内。采用本发明专利技术提供的方法能够显著提高发酵液中烟酰胺核糖激酶的酶活。此外，本发明专利技术根据发酵过程中OUR、ORP和乙酸浓度的波动情况并以此为基础进行工艺的微调，也可以缩减由于种子质量的波动所带来的发酵差异，有利于各批次间发酵水平的稳定。

【技术实现步骤摘要】
一种烟酰胺核糖激酶及烟酰胺单核苷酸的合成方法
本专利技术属于烟酰胺核糖激酶合成领域，具体涉及一种烟酰胺核糖激酶及烟酰胺单核苷酸的合成方法。
技术介绍
烟酰胺核糖激酶(nicotinamideribosidekinase，Nrk)是一种可调控烟酰胺单核苷酸(nicotinamidemononucleotide，NMN)生物合成的限速酶，它参与由烟酰胺核糖合成NMN的酶促反应。而在NAD+的生物合成过程中，NMN作为重要的底物，在人体中可作为细胞能量的来源。最近有研究表明，NMN可改善因NAD+缺乏所引起的心脑血管疾病、老年痴呆、2型糖尿病以及因年龄和饮食引发的肥胖，在许多临床研究当中，服用NMN可改善体内不同代谢器官的线粒体功能，并具有延缓衰老的作用，越来越多的证据表明，NMN具有广泛的保健应用和药物治疗价值。目前制备NMN的方法主要有化学合成法和体外酶转化法。其中，化学合成法步骤繁琐，每一步的合成均涉及到产物的收率损失，并可能产生许多顺式异构体及大量的有毒副产物，造成环境污染。体外酶转化法具有污染小、反应简便、产品活性高等特点，是制备NMN的较好方法，但其产物合成效率受转化酶的酶活影响，现有的烟酰胺核糖激酶酶活普遍较低，导致NMN酶转化存在耗时长和收率低等问题，难以实现较大规模生产。提高微生物合成烟酰胺核糖激酶的酶活有助于提高NMN酶转化合成的效率及成本的控制。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有的烟酰胺核糖激酶酶活较低的缺陷，而提供一种能够提高酶活的烟酰胺核糖激酶及烟酰胺单核苷酸的合成方法。本专利技术的专利技术人经过深入研究之后发现，不同菌种及不同发酵阶段的菌体的生长条件不同，烟酰胺核糖激酶生产菌株发酵过程中氧消耗速率(OxygenUptakeRate，以下采用缩写OUR)、发酵液中氧化还原电位(OxidationReductionPotential，以下采用缩写ORP)及乙酸浓度能够很好地反馈发酵过程，通过分阶段控制OUR、发酵液中ORP和乳酸浓度的范围，能够促进菌体对培养基的摄入，降低代谢副产物乙酸对菌体代谢的影响，减缓老化速度，使其能够更快地由生长阶段向合成阶段转变，保证发酵产物的合成速率，延长产物合成时长，更有利于烟酰胺核糖激酶酶活的提高。基于此，完成了本专利技术。具体地，本专利技术提供了一种烟酰胺核糖激酶的合成方法，其中，该方法包括将烟酰胺核糖激酶生产菌株依次进行菌株活化、种子扩大培养和发酵培养，且在发酵培养过程中，分阶段将OUR、发酵液中ORP和乙酸浓度中的至少一者控制在预定范围内；分阶段控制OUR的方式如下：发酵0～4hOUR控制在20～80mmol/L·h，4～10hOUR控制在140～200mmol/L·h，10～24hOUR控制在160～250mmol/L·h，24h～放罐OUR控制在100～180mmol/L·h；分阶段控制发酵液中ORP的方式如下：发酵0～4hORP控制在100～180mV，4～10hORP控制在-10～100mV，10～24hORP控制在20～120mV，24h～放罐ORP控制在60～150mV；分阶段控制发酵液中乙酸浓度的方式如下：发酵0～4h乙酸浓度控制在0.1～5g/L，4～10h乙酸浓度控制在0.5～10g/L，10～24h乙酸浓度控制在0.4～5g/L，24h～放罐乙酸浓度控制在0.2～5g/L。进一步地，分阶段控制OUR的方式如下：发酵0～4hOUR控制在30～80mmol/L·h，4～10hOUR控制在140～200mmol/L·h，10～24hOUR控制在160～230mmol/L·h，24h～放罐OUR控制在100～160mmol/L·h。进一步地，分阶段控制发酵液中ORP的方式如下：发酵0～4hORP控制在120～160mV，4～10hORP控制在0～70mV，10～24hORP控制在50～100mV，24h～放罐ORP控制在80～140mV。进一步地，分阶段控制发酵液中乙酸浓度的方式如下：发酵0～4h乙酸浓度控制在0.1～5g/L，4～10h乙酸浓度控制在1～10g/L，10～24h乙酸浓度控制在0.5～5g/L，24h～放罐乙酸浓度控制在0.3～5g/L。进一步地，所述OUR、发酵液中ORP和乙酸浓度通过调整通气量、转速及罐压中的至少一者得以控制。进一步地，本专利技术提供的烟酰胺核糖激酶的合成方法还包括在发酵过程中补加甘油以将发酵体系中甘油浓度控制在0.1～1g/L。进一步地，本专利技术提供的烟酰胺核糖激酶的合成方法包括以下步骤：(1)菌株活化：在无菌条件下，将烟酰胺核糖激酶生产菌株按照梯度稀释法接入含有20～40mg/L卡那霉素的平板培养基中，在温度28～40℃下培养15～25h；(2)种子培养：从培养好的平板培养基上挑取单菌落，接入装有摇瓶培养基的摇瓶内，之后放置于摇床中，在温度28～40℃、转速200～240rpm条件下培养10～20h，任选再以0.5～2％接种量接入种子罐中并于温度28～40℃、通气比0.5～2vvm、转速100～300rpm、罐压0.03～0.08MPa条件下培养4～10h，任选重复种子罐培养1～3次，得到种子液；(3)发酵培养：将培养好的种子液以1～5％接种量接入发酵罐中，在温度28～40℃、pH值6.5～7.5条件下进行发酵培养，发酵全程监测OUR、发酵液中ORP及乙酸浓度中的至少一者，发酵罐空气流量、转速及罐压根据OUR、发酵液中ORP及乙酸浓度变化而进行调整；发酵过程补加40～60％甘油控制甘油浓度在0.1～1g/L，发酵培养至5～20h时，于发酵液中加入IPTG，并降温至18～22℃继续培养至36h放罐。本专利技术还提供了由上述方法合成得到的烟酰胺核糖激酶。此外，本专利技术还提供了一种采用体外酶转化法合成烟酰胺单核苷酸的方法，其中，该方法所采用的转化酶为由上述方法所得烟酰胺核糖激酶。采用本专利技术提供的方法合成烟酰胺核糖激酶，根据发酵过程中OUR、ORP和乙酸浓度的变化情况对发酵过程进行调整，分阶段控制OUR、ORP和乙酸浓度，能够满足烟酰胺核糖激酶发酵在生长及合成等各阶段对培养条件的不同需求，促进菌体生长及产物合成，进而提高烟酰胺核糖激酶的发酵水平，缩短发酵周期并降低设备能耗，最终所得发酵液中烟酰胺核糖激酶酶活能够得以有效提高。另外，根据发酵过程中OUR、ORP和乙酸浓度的波动情况并以此为基础进行工艺的微调，也可以缩减由于种子质量的波动所带来的发酵差异，有利于各批次间发酵水平的稳定。再则，由于采用本专利技术提供的方法合成烟酰胺核糖激酶能够提高发酵液中烟酰胺核糖激酶的酶活，将由此获得的烟酰胺核糖激酶用于合成NMN，能够缩短时长并提高收率，应用前景广泛。具体实施方式本专利技术采用在线监测发酵过程OUR、发酵液中ORP及乙酸浓度中的至少一者来反馈调控发酵过程工艺参数，在发酵的不同阶段通过调整空气流量、转速及罐压中的至少一者，分阶段将OUR、发酵液中ORP及乙酸浓度中的至少一者控制在预定范围内，从而有效提高烟本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种烟酰胺核糖激酶的合成方法，其特征在于，该方法包括将烟酰胺核糖激酶生产菌株依次进行菌株活化、种子扩大培养和发酵培养，且在发酵培养过程中，分阶段将OUR、发酵液中ORP和乙酸浓度中的至少一者控制在预定范围内；/n分阶段控制OUR的方式如下：发酵0～4h OUR控制在20～80mmol/L·h，4～10h OUR控制在140～200mmol/L·h，10～24h OUR控制在160～250mmol/L·h，24h～放罐OUR控制在100～180mmol/L·h；/n分阶段控制发酵液中ORP的方式如下：发酵0～4h ORP控制在100～180mV，4～10h ORP控制在-10～100mV，10～24h ORP控制在20～120mV，24h～放罐ORP控制在60～150mV；/n分阶段控制发酵液中乙酸浓度的方式如下：发酵0～4h乙酸浓度控制在0.1～5g/L，4～10h乙酸浓度控制在0.5～10g/L，10～24h乙酸浓度控制在0.4～5g/L，24h～放罐乙酸浓度控制在0.2～5g/L。/n

【技术特征摘要】
1.一种烟酰胺核糖激酶的合成方法，其特征在于，该方法包括将烟酰胺核糖激酶生产菌株依次进行菌株活化、种子扩大培养和发酵培养，且在发酵培养过程中，分阶段将OUR、发酵液中ORP和乙酸浓度中的至少一者控制在预定范围内；
分阶段控制OUR的方式如下：发酵0～4hOUR控制在20～80mmol/L·h，4～10hOUR控制在140～200mmol/L·h，10～24hOUR控制在160～250mmol/L·h，24h～放罐OUR控制在100～180mmol/L·h；
分阶段控制发酵液中ORP的方式如下：发酵0～4hORP控制在100～180mV，4～10hORP控制在-10～100mV，10～24hORP控制在20～120mV，24h～放罐ORP控制在60～150mV；
分阶段控制发酵液中乙酸浓度的方式如下：发酵0～4h乙酸浓度控制在0.1～5g/L，4～10h乙酸浓度控制在0.5～10g/L，10～24h乙酸浓度控制在0.4～5g/L，24h～放罐乙酸浓度控制在0.2～5g/L。


2.根据权利要求1所述的烟酰胺核糖激酶的合成方法，其特征在于，分阶段控制OUR的方式如下：发酵0～4hOUR控制在30～80mmol/L·h，4～10hOUR控制在140～200mmol/L·h，10～24hOUR控制在160～230mmol/L·h，24h～放罐OUR控制在100～160mmol/L·h。


3.根据权利要求1所述的烟酰胺核糖激酶的合成方法，其特征在于，分阶段控制发酵液中ORP的方式如下：发酵0～4hORP控制在120～160mV，4～10hORP控制在0～70mV，10～24hORP控制在50～100mV，24h～放罐ORP控制在80～140mV。


4.根据权利要求1所述的烟酰胺核糖激酶的合成方法，其特征在于，分阶段控制发酵液中乙酸浓度的方式如下：发酵0～4h乙酸浓度控制在0.1～5g/L，4～10h乙酸浓度控制在1～10g/L，10～24h乙酸浓度控制...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟锦潮，陈必钦，严必能，王伟达，李丹，吴轶，詹光煌，
申请(专利权)人：内蒙古金达威药业有限公司，厦门金达威集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15