一种特种膜及其制备方法和应用以及β-烟酰胺单核苷酸的分离纯化方法技术

本发明专利技术属于酶促来源的β‑烟酰胺单核苷酸分离纯化领域，涉及一种特种膜及其制备方法和应用以及β‑烟酰胺单核苷酸分离纯化方法。所述特种膜的制备方法包括：将卤代烷烃和烯基取代咪唑进行亲电加成反应，反应结束后将产物真空浓缩至干并进行离子交换树脂提纯处理，往所得树脂提纯液中加入L‑脯氨酸搅拌溶解，之后将所得混合溶液与环糊精搅拌混溶，待溶液体系澄清透明后冷却至室温，固液分离，干燥，所得环糊精‑离子液体的包合物与明胶和致孔剂在溶剂中混合均匀得到成膜溶液，将该成膜溶液消泡后流延至支撑层的表面后冷却至室温。本发明专利技术提供的方法不仅能够获得较高的收率和纯度，而且特种膜能够循环利用。

【技术实现步骤摘要】
一种特种膜及其制备方法和应用以及β-烟酰胺单核苷酸的分离纯化方法
本专利技术属于酶促来源的β-烟酰胺单核苷酸分离纯化领域，具体涉及一种特种膜及其制备方法和应用以及β-烟酰胺单核苷酸的分离纯化方法。
技术介绍
β-烟酰胺单核苷酸(NMN)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的前体物质，其在人体内通过转化为NAD+来发挥生理功能，如激活NAD+底物依赖性酶Sirt1(组蛋白脱乙酰酶，又称沉默调节蛋白)、调节细胞存活和死亡、维持氧化还原状态等。近期研究发现，通过调节生物体内NMN的水平，对心脑血管疾病、神经退行性病及老化退行性疾病等有较好的治疗和修复作用。另外，NMN还可通过调节机体的内分泌起到保护和修复胰岛功能、增加胰岛素的分泌、防治糖尿病和肥胖等代谢性疾病的作用。鉴于NMN的重要生理功能，其已经成为近年来在世界医药及食品市场上开发的热点。近年来，以烟酰胺(VB3)及其核糖(NR)和三磷酸腺苷(ATP)为底物，在少量Mg2+参与下使用专一酶催化合成β-NMN的工艺路线逐渐成熟。相比化学合成法，酶催化法更为高效、绿色、环保、安全，是未来趋势所在。现阶段以酶催化反应液为原料的分离纯化NMN的工艺主要有反相层析法、交换树脂法等。CN104817604A公开了一种反相层析法制备β-NMN纯品的方法，该方法通过微滤、纳滤、浓缩、反相层析梯度洗脱、膜浓缩、真空冻干等步骤将NMN分离提纯，提纯效果较好，但工艺相对复杂，膜过滤及浓缩步骤较多，容易造成物料损失，反相层析填料昂贵且可重复利用次数有限，最终造成成本增加。CN108026132A公开了一种交换树脂法纯化β-NMN的方法，该方法使用阴离子交换树脂初步处理原料液后纳滤浓缩，将浓缩液经过螯合树脂处理，后续经浓缩、冻干后得到NMN纯品。然而，酶催化反应液中的杂质往往较为复杂，除了一些盐金属离子之外，还包含部分NMN副反应产物如多种磷类化合物、酶催化蛋白、细胞壁溶解糖类、细胞内核酸等，交换树脂对复杂原料的纯化程度有限，上样量较小，再生时用水量大并会产生大量废酸，多次循环使用后，往往容易造成填料失活、分离效果变差的情况。另外，β-烟酰胺单核苷酸结晶形态为长针状，在目前已知水系溶液直接结晶的工艺中，最终结晶品堆积密度往往偏小(堆积松密度通常小于0.4g/cm3)，这样会导致产品流动性较差，转移时容易起静电，给产品包装、制粒压片、胶囊灌装等步骤带来较大的不利影响。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术从酶催化反应液中分离提纯NMN时收率和/或纯度较低且填料或树脂无法长期循环利用的缺陷，而提供一种新的特种膜及其制备方法和应用以及β-烟酰胺单核苷酸的分离纯化方法，该方法不仅能够获得较高的收率和纯度，而且特种膜能够循环利用。为了实现以上专利技术目的，本专利技术提供了一种特种膜的制备方法，其中，该方法包括：将卤代烷烃和烯基取代咪唑以1:(1.5～3)的摩尔比于有机溶剂中进行亲电加成反应，反应结束后将产物浓缩至干，再将所得浓缩产物采用离子交换树脂进行提纯处理，往所得树脂提纯液中加入L-脯氨酸搅拌溶解，之后将所得混合溶液与环糊精于35～50℃下搅拌混溶，待溶液体系澄清透明后冷却至室温，固液分离，所得固体产物经干燥后得到环糊精-离子液体的包合物；将环糊精-离子液体的包合物与明胶和致孔剂在溶剂中于40～50℃下混合均匀得到成膜溶液，将该成膜溶液消泡后流延至支撑层的表面，冷却至室温后得到特种膜。优选地，所述亲电加成反应的方式为于50～90℃下回流反应2～5h。优选地，所述浓缩的条件包括温度为40～45℃，真空度为-0.09MPa～-0.1MPa。优选地，所述卤代烷烃选自1,3-二溴丙烷、溴代正丁烷、1,2-二氯代乙烷和1,2-二溴代乙烷中的至少一种。优选地，所述烯基取代咪唑选自乙烯基咪唑、1-乙烯基-3-丁基咪唑和1-烯丙基-3-乙烯基咪唑中的至少一种。优选地，所述离子交换树脂为阴离子交换树脂。优选地，采用离子交换树脂进行提纯处理的洗脱剂为水。优选地，所述树脂提纯液与L-脯氨酸的质量比为100:(10～40)。优选地，所述环糊精与烯基取代咪唑的摩尔比为(0.8～1.2):1，更优选为1:1。优选地，所述支撑层的材质为尼龙。优选地，所述支撑层的厚度为特种膜厚度的0.2～0.5倍。优选地，所述特种膜的厚度为0.8～1.5mm。优选地，将环糊精-离子液体的包合物与明胶和致孔剂在溶剂中于40～50℃下混合均匀的方式为将明胶水溶液和致孔剂水溶液混合均匀，之后往所得明胶-致孔剂混合物中缓慢滴加环糊精-离子液体的包合物，滴加完毕后于40～50℃下搅拌以形成均相。优选地，所述明胶水溶液的浓度为3～10wt％。优选地，所述致孔剂水溶液的浓度为2～6wt％。优选地，所述明胶水溶液与致孔剂水溶液的体积比为1:(1～1.5)。优选地，所述明胶-致孔剂混合物与环糊精-离子液体的包合物的质量比为1:(1.5～3.0)。优选地，所述致孔剂为聚丙烯酰胺。本专利技术还提供了由上述方法制备得到的特种膜。本专利技术还提供了所述特种膜在分离纯化β-烟酰胺单核苷酸中的应用。此外，本专利技术还提供了一种β-烟酰胺单核苷酸的分离纯化方法，待分离纯化的β-烟酰胺单核苷酸原料液为酶催化反应液，所述β-烟酰胺单核苷酸原料液中β-烟酰胺单核苷酸的含量为10～50g/L且pH值为4.0～7.5，其中，该方法包括：S1、原料液的预处理：将β-烟酰胺单核苷酸原料液的pH值调节至2～3，缓慢搅拌且缓慢升温至35～45℃，静置降温，待降至5～30℃后离心分离，将所得离心清液与吸附剂混合均匀，过滤，所得过滤清液浓缩至β-烟酰胺单核苷酸的浓度为40～85g/L，之后将pH值调节至6～8，得到待分离料液；S2、膜吸附分离：将上述特种膜在纯水中浸泡至少30min后取出，得到湿特种膜；将待分离料液升温至30～45℃，之后上样至湿特种膜上，上样完毕后，在30～35℃下采用酸和甲醇的混合溶液洗脱直至洗脱液中基本不含有β-烟酰胺单核苷酸后为止，收集洗脱液；S3、结晶：将洗脱液浓缩至β-烟酰胺单核苷酸的浓度为80～120g/L，之后在搅拌条件下往所得浓缩液中缓慢滴加甲醇直至有大量白色晶体出现为止，低温静置后固体分离，所得固体产物干燥，得到β-烟酰胺单核苷酸结晶。优选地，步骤S1中，所述离心分离的条件包括转速为4000～6000r/min，时间为5～10min。优选地，步骤S1中，所述吸附剂的用量为离心清液质量的0.5～2％。优选地，步骤S1中，所述吸附剂选自活性炭、硅藻土、珍珠岩和分子筛中的至少一种。优选地，步骤S1中，将过滤清液浓缩的方式为纳滤膜浓缩和/或真空浓缩设备浓缩。优选地，步骤S1中，所述浓缩的温度为20～50℃。优选地，步骤S2中，所述上样的条件包括上样量为0.03～0.1g折纯/cm2，过膜速度≤0.3mL/cm2·s，过膜压力≤4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种特种膜的制备方法，其特征在于，该方法包括：将卤代烷烃和烯基取代咪唑以1:(1.5～3)的摩尔比于有机溶剂中进行亲电加成反应，反应结束后将产物浓缩至干，再将所得浓缩产物采用离子交换树脂进行提纯处理，往所得树脂提纯液中加入L-脯氨酸搅拌溶解，之后将所得混合溶液与环糊精于35～50℃下搅拌混溶，待溶液体系澄清透明后冷却至室温，固液分离，所得固体产物经干燥后得到环糊精-离子液体的包合物；将环糊精-离子液体的包合物与明胶和致孔剂在溶剂中于40～50℃下混合均匀得到成膜溶液，将该成膜溶液消泡后流延至支撑层的表面，冷却至室温后得到特种膜。/n

【技术特征摘要】
1.一种特种膜的制备方法，其特征在于，该方法包括：将卤代烷烃和烯基取代咪唑以1:(1.5～3)的摩尔比于有机溶剂中进行亲电加成反应，反应结束后将产物浓缩至干，再将所得浓缩产物采用离子交换树脂进行提纯处理，往所得树脂提纯液中加入L-脯氨酸搅拌溶解，之后将所得混合溶液与环糊精于35～50℃下搅拌混溶，待溶液体系澄清透明后冷却至室温，固液分离，所得固体产物经干燥后得到环糊精-离子液体的包合物；将环糊精-离子液体的包合物与明胶和致孔剂在溶剂中于40～50℃下混合均匀得到成膜溶液，将该成膜溶液消泡后流延至支撑层的表面，冷却至室温后得到特种膜。


2.根据权利要求1所述的特种膜的制备方法，其特征在于，
所述亲电加成反应的方式为于50～90℃下回流反应2～5h；
优选地，所述浓缩的条件包括温度为40～45℃，真空度为-0.09MPa～-0.1MPa；
优选地，所述卤代烷烃选自1,3-二溴丙烷、溴代正丁烷、1,2-二氯代乙烷和1,2-二溴代乙烷中的至少一种；
优选地，所述烯基取代咪唑选自乙烯基咪唑、1-乙烯基-3-丁基咪唑和1-烯丙基-3-乙烯基咪唑中的至少一种；
优选地，所述离子交换树脂为阴离子交换树脂；
优选地，采用离子交换树脂进行提纯处理的洗脱剂为水；
优选地，所述树脂提纯液与L-脯氨酸的质量比为100:(10～40)；
优选地，所述环糊精与烯基取代咪唑的摩尔比为(0.8～1.2):1，优选为1:1；
优选地，所述支撑层的材质为尼龙；
优选地，所述支撑层的厚度为特种膜厚度的0.2～0.5倍；
优选地，所述特种膜的厚度为0.8～1.5mm。


3.根据权利要求1所述的特种膜的制备方法，其特征在于，将环糊精-离子液体的包合物与明胶和致孔剂在溶剂中于40～50℃下混合均匀的方式为将明胶水溶液和致孔剂水溶液混合均匀，之后往所得明胶-致孔剂混合物中缓慢滴加环糊精-离子液体的包合物，滴加完毕后于40～50℃下搅拌以形成均相；
优选地，所述明胶水溶液的浓度为3～10wt％；
优选地，所述致孔剂水溶液的浓度为2～6wt％；
优选地，所述明胶水溶液与致孔剂水溶液的体积比为1:(1～1.5)；
优选地，所述明胶-致孔剂混合物与环糊精-离子液体的包合物的质量比为1:(1.5～3.0)；
优选地，所述致孔剂为聚丙烯酰胺。


4.由权利要求1～3中任意一项所述的方法制备得到的特种膜。


5.权利要求4所述的特种膜在分离纯化β-烟酰胺单核苷酸中的应用。


6.一种β-烟酰胺单核苷酸的分离纯化方法，待分离纯化的β-烟酰胺单核苷酸原料液为酶催化反应液，所述β-烟酰胺单核苷酸原料液中β-烟酰胺单核苷酸的含量为10～50g/L且pH值为4.0～7.5，其特征在于，该方法包括：
S1、原料液的预处理：将β-烟酰胺单核苷酸原料液的pH值调节至2～3，缓慢搅拌且缓慢升温至35～45℃，静置降温，待降至5～30℃后离心分离，将所得离心清液与吸附剂混合均匀，过滤，所得过滤清液浓缩至β-烟酰胺单核苷酸的浓度为40～85g/L，...

【专利技术属性】
技术研发人员：甄明，廖炜程，霍明娟，王跃飞，王继明，窦婵玉，
申请(专利权)人：内蒙古金达威药业有限公司，厦门金达威集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15