一种生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种生物酶催化制备L

【技术实现步骤摘要】
一种生物酶催化制备L
‑
叔亮氨酸的方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种生物酶催化制备L
‑
叔亮氨酸的方法及其应用。

技术介绍

[0002]叔亮氨酸是一种非天然氨基酸，是一种亮氨酸衍生物，叔亮氨酸的空间位阻大、疏水性强，适合用于药物制造，比如抗病毒药物，例如抗艾滋病药物阿扎那韦、抗丙肝病毒药物特拉匹韦以及最近的Paxlovid；L
‑
叔亮氨酸的市场需求越来越大，现有的L
‑
叔亮氨酸的合成方法主要包括拆分法、化学合成法和酶催化合成法。
[0003]CN105399642A公开了一种同时制备D
‑
型叔亮氨酸和L
‑
型叔亮氨酸的方法，所述方法包括以下步骤：将正丁醇与1,1
‑
二氯乙烯反应，得到产物3,3
‑
二甲基丁酸；在3,3
‑
二甲基丁酸中加入催化剂，同时通入空气和氯气，进行氯代反应，得到2
‑
氯
‑
3,3
‑
二甲基丁酸；对得到的2
‑ꢀ
氯
‑
3,3
‑
二甲基丁酸进行氨解反应，得到D
‑
,L
‑
叔亮氨酸，对得到的D
‑
,L
‑
叔亮氨酸进行乙酰化和氯乙酰化，然后用L
‑
热稳定氨基酸酰化酶进行拆分和其它处理，分别得到L
‑/>叔亮氨酸和 D
‑
叔亮氨酸。但是采用化学合成法的收率低，需要使用有毒的气体，污染环境，工艺路线较长。
[0004]CN102533888A公开了一种使用酶连续拆分含氮有机化合物外消旋体制备旋光异构体的方法，所述方法以N
‑
苯乙酰
‑
DL
‑
叔亮氨酸和无机碱为原料，通过氨基酰化酶反应柱，在酶催化作用下选择性水解N
‑
苯乙酰
‑
L
‑
叔亮氨酸，生成L
‑
叔亮氨酸和苯乙酸，反应结束后，将反应液调酸，酸化后抽滤，从滤液中提纯得到L
‑
叔亮氨酸，从滤渣中分离出未反应的N
‑
苯乙酰
ꢀ‑
D
‑
叔亮氨酸，将N
‑
苯乙酰
‑
D
‑
叔亮氨酸经高温回流消旋后再投入拆分反应，从而实现连续化的循环拆分N
‑
苯乙酰
‑
DL
‑
叔亮氨酸，制备L
‑
叔亮氨酸。
[0005]CN104561161A公开了一种海洋酶催化不对称还原制备手性叔亮氨酸的方法及酶，所述酶是一种亮氨酸脱氢酶，所述亮氨酸脱氢酶来源于柴油食烷菌(Alcanivorax dieselolei)。所述方法包括以下步骤：构建表达所述亮氨酸脱氢酶的工程菌，培养所述工程菌制备细胞液，利用细胞液催化三甲基丙酮酸不对称还原胺化得到产物手性叔亮氨酸。
[0006]酶催化具有绿色无污染的优势，并且光学纯度高，酶催化主要是用三甲基丙酮酸酶催化合成，但是底物和辅酶占成本的主要部分，同时在反应过程中存在底物抑制作用。因此，提供一种实现辅酶NADH自循环且没有底物抑制的生物酶催化制备L
‑
叔亮氨酸的方法具有重要应用前景。

技术实现思路

[0007]针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种生物酶催化制备L
‑
叔亮氨酸的方法及其应用。本专利技术采用三甲基丙酮酸的前体2
‑
羟基
‑
3,3
‑
二甲基丁酸作为底物，用筛选出的特异性的2
‑
羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶偶联反应，实现了辅酶NADH自循环，不用额外添加辅酶循环体系；三甲基丙酮酸生成后被L
‑
亮氨酸脱氢酶反应掉转化成L
‑
叔亮氨
酸，没有底物抑制作用；本专利技术所述2
‑
羟基酸脱氢酶是从乳酸菌属中筛选出来的，对α
‑
羟基丁酸具有较宽的底物选择性。本专利技术中所述生物酶催化制备L
‑
叔亮氨酸的方法具有操作简单、无需添加额外NADH、收率高和生产成本低等优势，环保安全、绿色无污染，在工业生产上具有广阔的应用前景。
[0008]为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0009]第一方面，本专利技术提供一种生物酶催化制备L
‑
叔亮氨酸的方法，所述生物酶催化制备L
‑ꢀ
叔亮氨酸的方法包括如下步骤：
[0010]以2
‑
羟基
‑
3,3
‑
二甲基丁酸为底物，在2
‑
羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的催化下反应得到 L
‑
叔亮氨酸。
[0011]优选地，所述2
‑
羟基酸脱氢酶包括D
‑2‑
羟基酸脱氢酶和L
‑2‑
羟基酸脱氢酶。
[0012]优选地，所述D
‑2‑
羟基酸脱氢酶的编码基因包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
[0013]优选地，所述L
‑2‑
羟基酸脱氢酶的编码基因包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
[0014]优选地，所述亮氨酸脱氢酶包括L
‑
亮氨酸脱氢酶。
[0015]本专利技术以2
‑
羟基
‑
3,3
‑
二甲基丁酸作为底物，在2
‑
羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的催化下反应得到L
‑
叔亮氨酸，本专利技术中的方法为酶催化生物合成法，具有操作简单、无需添加额外 NADH、收率高、生产成本低等优势。
[0016]优选地，所述L
‑
亮氨酸脱氢酶的编码基因包括SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
[0017]SEQ ID NO.1：
[0018]ATGAAGATCATCGCGTACGGCATTCGTGATGATGAACAGCCGTATCTGGAACAGTG GTCTAAAGACCAGGGTATCGAAGTTAAGGCGGTTAAAGAGCTGCTGGATGACTCCACCG TTGATCTGGCTAAGGGTTACGACGGCGCGGTGGTGTACCAGCAGAAACCGTACACCGCT TCCGTTCTGGATAAACTGGCGGCGAACGGTGTTACTAACCTGAGCCTGCGCAATGTTGG TGTCGACAACGTAGACGCGGACGCCGTGAAACGTAACGGTTTCAAGGTTACGAACGTA CCAGCATACAGCCCGGAAGCCATCGCGGAGTT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生物酶催化制备L
‑
叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述生物酶催化制备L
‑
叔亮氨酸的方法包括如下步骤：以2
‑
羟基
‑
3,3
‑
二甲基丁酸为底物，在2
‑
羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的催化下反应得到L
‑
叔亮氨酸。2.根据权利要求1所述的生物酶催化制备L
‑
叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述2
‑
羟基酸脱氢酶包括D
‑2‑
羟基酸脱氢酶和L
‑2‑
羟基酸脱氢酶；优选地，所述D
‑2‑
羟基酸脱氢酶的编码基因包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；优选地，所述L
‑2‑
羟基酸脱氢酶的编码基因包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；优选地，所述亮氨酸脱氢酶包括L
‑
亮氨酸脱氢酶；优选地，所述L
‑
亮氨酸脱氢酶的编码基因包括SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。3.根据权利要求1或2所述的生物酶催化制备L
‑
叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述生物催化反应包括如下步骤：将2
‑
羟基
‑
3,3
‑
二甲基丁酸、氨基供体和水混合，加热升温，调节反应液的pH，加入2
‑
羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的混合酶粉和NAD
+
，进行生物催化反应；优选地，所述2
‑
羟基
‑
3,3
‑
二甲基丁酸、氨基供体和水混合的质量比为(1.3～1.5):(0.8～1.5):(20～40)；优选地，所述氨基供体包括硫酸铵；优选地，所述加热的温度为38～42℃；优选地，采用pH调节剂调节反应液的pH为8.5～9.5；优选地，所述pH调节剂包括氨水；优选地，所述2
‑
羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的混合酶粉的添加量占反应液总质量的0.2～0.4％；优选地，所述NAD
+
的添加量占反应液总质量的0.3～0.8％；优选地，所述生物催化反应的温度为35～40℃，所述生物催化反应的时间为1～4h。4.根据权利要求1～3中任一项所述的生物酶催化制备L
‑
叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述2
‑
羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的混合酶粉的制备方法包括如下步骤：(1)制备表达D
‑2‑
羟基酸脱氢酶、L
‑2‑
羟基酸脱氢酶和L
‑
亮氨酸脱氢酶的共表达载体，将共表达载体导入底盘细胞中，得到基因工程菌；(2)将步骤(1)所得基因工程菌进行发酵培养得到菌体；(3)将步骤(2)所得菌体制成2
‑
羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的混合酶粉。5.根据权利要求4所述的生物酶催化制备L
‑
叔亮氨酸的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述基因工程菌的制备方法包括如下步骤：合成编码D
‑2‑
羟基酸脱氢酶与L
‑
亮氨酸脱氢酶的基因片段a，合成编码L
‑2‑
羟基酸脱氢酶与L
‑
亮氨酸脱氢酶的基因片段b；将基因片段a和基因片段b克隆至表达载体上，获得共表达载体，将共表达载体导入底盘细胞中，得到基因工程菌；优选地，所述基因片段a中还包括RBS序列；优选地，所述基因片段b中还包括RBS序列；优选地，所述RBS序列包括SEQ ID NO.4～6所示的核苷酸序列中任意一种；
优选地，所述表...

【专利技术属性】
技术研发人员：祝俊，徐飞，王苓，何宝亮，李丹，李斌，陈剑，余长泉，
申请(专利权)人：内蒙古金达威药业有限公司南京桦冠生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：