一种微生物发酵制备L-茶氨酸的方法技术

本发明专利技术涉及一种微生物发酵制备L

【技术实现步骤摘要】
一种微生物发酵制备L
‑
茶氨酸的方法


[0001]本专利技术属于微生物发酵
，具体涉及一种微生物发酵制备L
‑
茶氨酸的方法。

技术介绍

[0002]L
‑
茶氨酸(L
‑
Theanine)又称N
‑
乙基
‑
L
‑
谷氨酰胺，是茶叶中特有的甜味游离氨基酸。茶氨酸含量因茶的品种、部位而有所不同。茶氨酸在干茶中占重量的 1％
‑
2％。茶氨酸在化学构造上与脑内活性物质谷酰胺、谷氨酸相似，是茶叶中生津润甜的主要成份。茶被誉为万病之药，早在东汉的《神农本草经》、唐代陈藏器的《本草拾遗》、明代顾元庆《茶谱》中，就有对茶叶的药用功效进行了记载，不过限于当时的科技水平，茶在药用保健方面的记载多是经验性的。茶之所以能够提升免疫力，主要是含有茶多酚、茶氨酸、生物碱等多种营养成分，茶氨酸因其特有的功效，引起了医药、保健品、食品等领域的广泛关注，为此，茶氨酸曾在1998年德国召开的国际食品原料会上获得了研究部门大奖。
[0003]L
‑
茶氨酸具有促进机体吸收与代谢、调节脑内神经传达物质、提高学习能力和记忆力、保护神经细胞、提高抗癌药物活性等作用，还有镇静、减肥的功效。一般有提取法、化学合成法、微生物酶法等制备方式，中国专利CN104561160A 公开了一种酶法制备方式，即硝基还原假单胞菌发酵获得菌体，然后放入谷氨酰胺和乙胺盐中进行反应，经脱色、膜过滤等方式获得茶氨酸。 CN201910023533.4公开了一种发酵法生产茶氨酸的方法，即采用黄色短杆菌和硝基还原假单胞菌2种单独菌体进行发酵培养，然后加乙胺反应获得茶氨酸发酵液。以上方式虽然都得到了目标产物，但酶法工艺路线较长，采用2种菌共同发酵，容易造成染菌或菌体生长比例有差异等问题，两者生产成本相对较高。提取法和化学合成法能耗高且污染较大，不符合绿色工业的发展趋势。

技术实现思路

[0004]为了解决上述问题，本专利技术提供了一种利用微生物发酵制备L
‑
茶氨酸的方法法，即采用含有γ
‑
谷氨酰胺转肽酶和茶氨酸合成酶的大肠杆菌，发酵生产茶氨酸，本专利技术采用了单一微生物，生产条件温和，周期短，成本较低，便于工业化生产，有利于增强本产品的国际市场竞争力。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术采用的具体方案为：
[0006]一种微生物发酵制备L
‑
茶氨酸的方法，包含以下步骤：
[0007]制备发酵液：采用大肠杆菌种子进行培养基扩培后，接入发酵罐进行发酵培养，使用氢氧化钠调节pH值，过程流加葡萄糖溶液，间隔4h取样检测OD含量，当OD大于等于30时，开始同时流加葡萄糖溶液和乙胺盐酸溶液，过程检测L
‑
茶氨酸生成量，当2h内L
‑
茶氨酸含量不再增加，加入去离子水稀释，升温灭活后将转化液放出，得L
‑
茶氨酸发酵液。
[0008]制备粗粉：将发酵所得L
‑
茶氨酸料液经板框压滤机过滤后去除菌渣，所得料液进行多通道40
‑
60纳米陶瓷滤器去除大分子蛋白，所得清液进行超滤、电渗析脱除杂质和无机
盐后，浓缩至30％，加入乙醇，茶氨酸浓缩液与乙醇体积比为 1:1
‑
3，降温0
‑
5℃，结晶得到粗粉。
[0009]粗粉提纯：将L
‑
茶氨酸粗粉配置成质量分数为15
‑
30％的水溶液，加入质量分数为0.3
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0.8％的活性炭并升温至60
‑
80℃，搅拌状态下保温20
‑
50分钟后，热过滤去除活性炭，然后进行0.45μm微孔过滤，向过滤清液中缓慢加入乙醇，茶氨酸料液与乙醇体积比为1:3
‑
5，过程中出现浑浊状态时，加入质量分数 0.1
‑
0.3％的茶氨酸晶种，养晶20
‑
50分钟，继续流加乙醇至完全，缓慢搅拌状态下降温至0℃以下，保温1
‑
3h后进行固液分离，所得湿粉干燥后得成品。
[0010]所述乙胺盐酸溶液：葡萄糖溶液重量比为15
‑
20:100，乙胺盐酸溶液质量分数为20
‑
30％，葡萄糖溶液初始浓度为2％，后期流加用量为初始发酵液体积的40％。
[0011]所述乙醇质量分数为95
‑
100％。
[0012]所述步骤(1)中的发酵菌体培养条件：用10％NaOH调节pH值为6.5
‑
7.6，温度为30
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40℃，发酵生产周期为30
‑
48h。
[0013]所述步骤(1)中发酵培养基的配方包括如下组分：胰蛋白胨8
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12g/L、酵母提取物3
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7g/L、氯化钠8
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12g/L、葡萄糖浓度为2％。
[0014]所述发酵培养基的配方还包括：硫酸铵0.08
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0.15g/L、磷酸氢二钾0.2
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0.5g/L、磷酸氢二钠0.15
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0.2g/L、硫酸锰0.001
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0.003g/L、氯化镁0.01
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0.03g/L。
[0015]所述发酵培养基的配方还包括磷酸吡哆醛，磷酸吡哆醛与葡萄糖溶液重量比为0.005
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0.02:100。
[0016]所述步骤(2)中纳米陶瓷滤器的过滤条件为，压力≤0.8mpa，料液温度≤45℃，供料流量2.5
‑
3.5t/h。
[0017]本专利技术与现有技术相比，具有以下优点：
[0018]发酵液茶氨酸含量高，生产效率高，单位时间产能较大。
[0019]发酵生产周期30
‑
48h，转化完成后茶氨酸含量在110
±
20g/L，收率达90％。
[0020]本专利技术发酵过程简单，成本低廉，减少了酶提取环节，同时也改变了两种菌共同发酵培养的过程，便于工业化生产。
具体实施方式
[0021]以下通过具体实施例进一步说明本专利技术，但本领域技术人员应当知晓本专利技术的具体实施例并不以任何方式限制本专利技术，且在本专利技术基础上所作出的任何等同替换均落入本专利技术的保护范围。
[0022]实施例1：
[0023]制备发酵液：采用大肠杆菌种子进行培养基扩培后，接入发酵罐进行发酵培养，初始培养基中葡萄糖浓度为2％，使用10％氢氧化钠调节pH值6.5，温度为 30℃，过程流加浓度为55％的葡萄糖溶液，间隔4h取样检测OD含量，当OD 大于等于30时，开始同时流加葡萄糖和质量分数为20％乙胺盐酸溶液，后期流加葡萄糖总量为初始发酵液体积的40％，乙胺盐酸流加量为葡萄糖用量的15％。过程检测L<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种微生物发酵制备L
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茶氨酸的方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)制备发酵液：采用大肠杆菌种子进行培养基扩培后，接入发酵罐进行发酵培养，使用氢氧化钠调节pH值，过程流加葡萄糖溶液，间隔4h取样检测OD含量，当OD大于等于30时，开始同时流加葡萄糖溶液和乙胺盐酸溶液，过程检测L
‑
茶氨酸生成量，当2h内L
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茶氨酸含量不再增加，加入去离子水稀释，升温灭活后将转化液放出，得L
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茶氨酸发酵液；(2)制备粗粉：将发酵所得L
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茶氨酸料液经板框压滤机过滤后去除菌渣，所得料液进行多通道40
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60纳米陶瓷滤器，所得清液进行超滤、电渗析脱除杂质和无机盐后，浓缩至30％，加入乙醇，茶氨酸浓缩液与乙醇体积比为1:1
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3，降温0
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5℃，结晶得到粗粉；(3)粗粉提纯：将L
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茶氨酸粗粉配置成质量分数为15
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30％的水溶液，加入质量分数为0.3
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0.8％的活性炭并升温至60
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80℃，搅拌状态下保温20
‑
50分钟后，热过滤去除活性炭，然后进行0.45μm微孔过滤，向过滤清液中缓慢加入乙醇，茶氨酸料液与乙醇体积比为1:3
‑
5，过程中出现浑浊状态时，加入质量分数0.1
‑
0.3％的茶氨酸晶种，养晶20
‑
50分钟，继续流加乙醇至完全，缓慢搅拌状态下降温至0℃以下，保温1
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3h后进行固液分离，所得湿粉干燥后得成品。2.根据权利要求1所述的微生物发酵制备L
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茶氨酸的方法，其特征在于，所述乙胺盐酸溶液：葡萄糖溶液重量比为15
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20:100，乙胺盐酸溶液质量分数为20

【专利技术属性】
技术研发人员：李斌水，何连顺，
申请(专利权)人：精晶药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：