一种制备(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种制备(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸的方法。本发明专利技术的方法以3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸酯为底物，乙二醇为助溶剂，在弱碱性条件以及转氨酶的催化作用下，一锅法生成(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸。本发明专利技术一步得到目标产物，操作简单，反应条件温和，适合工业化生产。适合工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种制备(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸的方法

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[0001]本专利技术属于生物催化
，具体涉及一种利用转氨酶一步催化制备(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸的方法。

技术介绍
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[0002]西他列汀磷酸盐是由默克公司开发的一种治疗Ⅱ型糖尿病的药物，商品名为捷诺维(Januvia)，于2006年经美国FDA批准后上市，在全球多个国家被批准使用。该药主要通过抑制二肽基肽酶-4(DPP-4)的活性，保护内源性肠降血糖素和增强其作用而控制血糖水平。经临床研究表明，该药物是一个口服有效、单用或与二甲双胍、吡格列酮合用都有明显的降血糖作用，具有口服安全，耐受性好，不良反应少等优点。由于受到专利对该产品的限制，多家医药公司从合成该药的重要手性氨基中间体着手研究，其中(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸就是合成西他列汀磷酸盐的一个重要的手性中间体，西他列汀磷酸盐的合成路线如Scheme 1所示。
[0003][0004]围绕手性氨基中间体的酶法制备，中国专利CN105018440B公开一种从来源于分支杆菌(Mycobacterium vanbaalenii)PYR-1中钓取新的转氨酶，对3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯进行转化，获得具有高手性的(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯产物。
[0005]中国专利CN10728616A公开一种利用来源节杆菌的转氨酶，对3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸羟基酯类底物进行转化，获得对应的(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸羟基酯，再经过LiOH强碱水解，获得(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸中间体。
[0006]中国专利CN108586346A公开一种利用来源节杆菌的转氨酶突变体，对3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸酰胺类底物进行反应，获得对应的(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸酰胺产物。
[0007]当前报道的西他列汀磷酸盐中间体酶法合成中，仍以手性氨基酯类产物为主，后续要经过强碱的处理，再水解为β-氨基酸终产物；另外，反应体系以DMSO为助溶剂的转化效率不高，且反应过程也受到底物的抑制，这些现实问题都影响该中间体的生产效率和成本。因此，针对于西他列汀磷酸盐中间体(I)的酶法制备，仍有待于进一步改进和提高。

技术实现思路
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[0008]本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种操作简单易于产业化的(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸的制备方法。
[0009]本专利技术采用的技术方案如下：
[0010][0011]其中，R1为C1-C4的烷基取代基。
[0012]本专利技术提供一种制备(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸的方法，具体包括如下步骤：以3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸酯为底物，乙二醇为助溶剂，在弱碱性条件下，在转氨酶的催化作用下一锅法生成(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸。
[0013]进一步，一锅酶法制备(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸的操作步骤为：用乙二醇为助溶剂，溶解3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸酯类底物，配制成一定浓度，在2h内加入反应体系；配制一定浓度的缓冲溶液为反应介质，向反应介质中投加一定量的异丙胺、磷酸吡哆醛、乙二醇和转氨酶；在一定温度下搅拌反应，利用一定浓度的异丙胺控制反应过程中的pH；反应结束利用高效液相色谱法分析转化率和产物的光学纯度。
[0014]进一步，所述底物3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸酯浓度为50～300mM，优选100mM。
[0015]更进一步，所述3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸酯类底物为3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸乙酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸异丙酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸叔丁酯等，优选3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸乙酯。
[0016]进一步，所述乙二醇在反应体系中的浓度为5～50％(V/V)，优选反应体系浓度为20％
[0017]进一步，所述弱碱性条件为pH＝7.5～10.0，优选pH＝9.0。
[0018]进一步，所述转氨酶来自于节杆菌Arthrobacter sp。
[0019]进一步，该反应在反应温度为30～60℃条件下进行，优选50℃。
[0020]本专利技术的有益效果在于，通过对转氨酶有机溶剂的优化，发现乙二醇作为助溶剂，不仅提高了转氨酶对3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸酯类的催化效率，同时反应结束后，可以直接获得(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸产物，光学纯度>99％，转化率>96％。
附图说明
[0021]图1转氨酶的蛋白电泳图
具体实施方式
[0022]下面结合具体实施例对本专利技术的
技术实现思路
作进一步的阐述，其目的是为了更好的理解本专利技术的内容，但本专利技术的保护范围不限于此。
[0023]实施例1节杆菌转氨酶蛋白在大肠杆菌中的表达
[0024]借助NCBI网站，获取转氨酶的野生型基因序列，通过密码子优化后，人工设计并全基因合成，在基因的两端分别引入NdeI和XhoI酶切位点，并克隆到pET-24a载体上。将上述构建好的重组质粒经过化学转化方法，转入DH5α感受态细胞，在含有Kan
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抗性的LB平板上37℃隔夜倒置培养。挑选阳性单克隆进行基因测序，确定序列正确后，将重组表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，提出单克隆细胞，获得可以诱导表达的节杆菌转氨酶基因工程菌株。
[0025]将含有目的基因的BL21(DE3)细胞接种到含有Kan
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抗性的LB试管中，于37℃培养过夜，得到一级种子培养液。将种子培养液按照1％的接种比例转接到含有抗性的2YT液体培养基中，置于摇床中，37℃下，200rpm转速培养3-5h，测OD达到0.6～0.8时，降温至20℃，加入IPTG，浓度控制在0.2mM，进行隔夜诱导表达。发酵液通过离心并收集菌体，用磷酸盐缓冲液将收集的菌体进行溶解，并在高压均质机中进行破碎细胞，再次12000rpm离心10min后，得到的上清液即为转氨酶蛋白，通过电泳可以看见蛋白的表达情况，见附图1。
[0026]实施例2转氨酶细胞在不同有机溶剂下的转氨反应
[0027]先用1mL不同的有机溶剂溶解3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸乙酯底物各0.26g，配制成100mM的底物浓度。所有反应体系都控制在10mL，依次向反应釜中加入1mL 1M的pH 9.0三乙醇胺缓冲液，1mL 10mM的磷酸吡哆醛，1mL 3M的异丙胺和0.5g酶细胞，每个反应釜对应不同有机溶剂本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸(I)的方法，其特征在于以3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸酯(II)为底物，乙二醇为助溶剂，在弱碱性条件以及转氨酶的催化作用下，一锅法生成(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸。反应过程如下所示：其中，R1为C1-C4的烷基取代基。2.一种如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述底物3-羰基-4-(2,4,5-...

【专利技术属性】
技术研发人员：竺伟，张小飞，马斌祥，
申请(专利权)人：尚科生物医药上海有限公司，
类型：发明
国别省市：