T7 RNA聚合酶变体制造技术

本文中提供了具有增加的RNA聚合酶活性和/或热稳定性的T7 RNA聚合酶变体(T7 RNAP变体)及其使用方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】T7RNA聚合酶变体相关申请本申请要求2018年4月10日提交的美国临时申请号62/655,747的35U.S.C.§119(e)下的权益，其内容通过引用完整并入本文。专利技术背景在基因表达过程中脱氧核糖核酸(DNA)转录为核糖核酸(RNA)是一种基本的细胞过程，其当RNA聚合酶附着于DNA模板以开始RNA聚合时发生。基本的细胞过程如转录通常在37℃下发生，并且包括RNA聚合酶在内的许多酶通常在37℃以上的温度下均无活性。因此，在升高的温度下生成RNA需要在高温下具有增加的热稳定性的RNA聚合酶变体。专利技术概述本公开内容提供了具有增强的热稳定性的T7RNA聚合酶(RNAP)变体。这些变体在RNA合成反应中的使用导致RNA产率和产物概况的改善(相对于野生型T7RNAP，即使在高于37℃的温度下)。通过鉴定预测为改善蛋白质稳定性并对亲和力的影响最小化的个别突变，合理设计了这些变体。然后测试被工程化改造以包括那些突变的特定组合的变体，以鉴定具有改善的性质，例如在升高的温度下改善的RNA生成的T7RNAP变体。因此，本公开内容的一些实施方案提供了T7RNAP变体，其在由SEQIDNO:1鉴定的氨基酸序列中包含至少一个氨基酸取代，其中至少一个氨基酸取代在选自下组的位置处：I320、I396、F546、S684和G788。在一些实施方案中，本公开内容提供了T7RNAP变体，其在由SEQIDNO:1鉴定的氨基酸序列中包含至少两个氨基酸取代，其中至少两个氨基酸取代在选自下组的位置处：I320、I396、F546、S684和G788。在一些实施方案中，T7RNAP变体在由SEQIDNO:1鉴定的氨基酸序列的位置处：I320、I396、F546、S684和G788(M1)处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，T7RNAP变体在由SEQIDNO:1鉴定的氨基酸序列的位置处：I320，I396和G788(M2)处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，T7RNAP变体在由SEQIDNO:1鉴定的氨基酸序列的位置处：I396、S684和G788(M3)处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，T7RNAP变体在由SEQIDNO:1鉴定的氨基酸序列的位置处：I320、S684和G788(M4)处包含氨基酸取代。SEQIDNO:1的氨基酸序列是T7RNAP的野生型序列。在一些实施方案中，本公开内容提供了包含本文所述的T7RNAP变体的组合物、试剂盒、系统和方法。在一些实施方案中，本公开内容提供了生成核糖核酸(RNA)的方法。在一些实施方案中，这些方法包括将如本文提供的T7RNA聚合酶变体与核苷三磷酸和编码目标RNA的脱氧核糖核酸(DNA)模板组合，并生成目标RNA。附图简述图1是显示在25μL反应(n＝3)中在反应温度下温育2小时后由T7RNA聚合酶变体生成的双链RNA(dsRNA)产物滴度(ng/μL)的图。图2是显示基于温度由T7RNA聚合酶变体生成的％RNA的比较的图。专利技术详述噬菌体T7RNA聚合酶(T7RNAP)是一种DNA依赖性RNA聚合酶，属于DNA聚合酶I家族。野生型T7RNAP包含883个氨基酸，对应于SEQIDNO:1。野生型T7RNAP在37℃，pH7.5时具有聚合酶活性，并且在较高温度下无活性。因此，本公开内容的一些方面提供了与野生型T7RNA聚合酶相比在高温下具有增加的热稳定性和改善的RNA生成的T7RNA聚合酶变体。本文公开的T7RNA聚合酶变体可以在37℃或更高的温度下进行的多种方法中使用。T7RNA聚合酶变体本公开内容的一些方面提供了噬菌体T7RNA聚合酶(T7RNAP)变体，其与由SEQIDNO:1鉴定的天然存在的T7RNAP的氨基酸序列不同。在一些实施方案中，本文提供了T7RNAP变体，其在SEQIDNO:1的氨基酸序列中包含至少一个氨基酸取代，其中至少一个取代在选自下组的一个或多个位置处：I320、I396、F546、S684和G788。在一些实施方案中，至少一个氨基酸取代在由SEQIDNO:1鉴定的氨基酸序列中的位置I320处。在一些实施方案中，至少一个氨基酸取代在由SEQIDNO:1鉴定的氨基酸序列中的位置I396处。在一些实施方案中，至少一个氨基酸取代在SEQIDNO:1鉴定的氨基酸序列中的位置F546处。在一些实施方案中，至少一个氨基酸取代在鉴定的氨基酸序列中的S684位置处。在一些实施方案中，至少一个氨基酸取代在由SEQIDNO:1鉴定的氨基酸序列中的位置G788处。在一些实施方案中，本文中提供了在SEQIDNO:1的氨基酸序列中包含至少两个、至少三个或至少四个氨基酸取代的T7RNAP变体，其中至少两个、至少三个、至少四个氨基酸或所有五个取代在选自下组的位置处：I320、I396、F546、S684和G788。在一些实施方案中，T7RNAP变体在SEQIDNO:1的氨基酸序列中包含至少两个氨基酸取代，其中至少两个氨基酸取代在选自下组的位置处：I320、I396、F546、S684和G788。在一些实施方案中，至少两个氨基酸取代在由SEQIDNO:1鉴定的氨基酸序列中的位置I320和I396。在一些实施方案中，至少两个氨基酸取代在氨基酸序列中的氨基酸位置I320和F546。在一些实施方案中，至少两个氨基酸取代在由SEQIDNO:1鉴定的氨基酸序列中的位置I320和S684处。在一些实施方案中，至少两个氨基酸取代在SEQIDNO:1鉴定的氨基酸序列中的位置I320和G788处。在一些实施方案中，至少两个氨基酸取代在由SEQIDNO:1鉴定的氨基酸序列中的位置I396和F546处。在一些实施方案中，至少两个氨基酸取代在由SEQIDNO:1鉴定的氨基酸序列中的位置I396和S684处。在一些实施方案中，至少两个氨基酸取代在由SEQIDNO:1鉴定的氨基酸序列中的位置I396和G788处。在一些实施方案中，至少两个氨基酸取代在由SEQIDNO:1鉴定的氨基酸序列中的位置F546和S684处。在一些实施方案中，至少两个氨基酸取代在由SEQIDNO:1鉴定的氨基酸序列中的位置F546和G788处。在一些实施方案中，至少两个氨基酸取代在由SEQIDNO:1鉴定的氨基酸序列中的位置S684和G788处。在一些实施方案中，T7RNAP变体在由SEQIDNO:1鉴定的氨基酸序列中包含至少三个氨基酸取代，其中至少三个氨基酸取代在选自下组的位置处：I320、I396、F546、S684和G788。在一些实施方案中，至少三个氨基酸取代在由SEQIDNO:1鉴定的氨基酸序列中的位置I320、I396和F546处。在一些实施方案中，至少三个氨基酸取代在由SEQIDNO:1鉴定的氨基酸序列中的位置I320、I396和S684处。在一些实施方案中，至少三个氨基酸取代在由SEQIDNO:1鉴定的氨基酸序列中的位置I320、I396和G788处。在一些实施方案中，至少三个氨基酸取代在由SEQIDNO:1鉴定的氨基酸序列中的位置I320、F5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.T7 RNA聚合酶变体，其在SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少70％同一性的氨基酸序列中包含至少三个氨基酸取代，其中所述至少三个氨基酸取代在选自下组的位置处：I320、I396、F546、S684和G788。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180410 US 62/655,7471.T7RNA聚合酶变体，其在SEQIDNO:1的氨基酸序列或与SEQIDNO:1具有至少70％同一性的氨基酸序列中包含至少三个氨基酸取代，其中所述至少三个氨基酸取代在选自下组的位置处：I320、I396、F546、S684和G788。


2.权利要求1的T7RNA聚合酶变体，其中所述变体在由SEQIDNO:1鉴定的氨基酸序列中包含I320L取代。


3.权利要求1的T7RNA聚合酶变体，其中所述变体在由SEQIDNO:1鉴定的氨基酸序列中包含I396L取代。


4.权利要求1的T7RNA聚合酶变体，其中所述变体在由SEQIDNO:1鉴定的氨基酸序列中包含F546W取代。


5.权利要求1的T7RNA聚合酶变体，其中所述变体在由SEQIDNO:1鉴定的氨基酸序列中包含S684A取代。


6.权利要求1的T7RNA聚合酶变体，其中所述变体在由SEQIDNO:1鉴定的氨基酸序列中包含G788A取代。


7.权利要求1的T7RNA聚合酶变体，其中所述变体包含取代I320L、I396L、F546W、S684A和G788A。


8.权利要求7的T7RNA聚合酶变体，其中所述变体包含由SEQIDNO:2鉴定的氨基酸序列。


9.权利要求1的T7RNA聚合酶变体，其包含取代I320L、I396L和G788A。


10.权利要求9的T7RNA聚合酶变体，其包含由SEQIDNO:3鉴定的氨基酸序列。


11.权利要求1的T7RNA聚合酶变体，其包含取代I396L、S684A和G788A。
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【专利技术属性】
技术研发人员：R贾因，
申请(专利权)人：绿光生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US