使用GCY1和DAK1来增加酵母的乙醇生产的组合物和方法技术

本文描述了组合物和方法，所述组合物和方法涉及与外源磷酸转酮酶途径组合的表达甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶多肽的酵母，并且涉及甘油脱氢酶‑二羟基丙酮激酶双功能融合多肽；以及所述组合物和方法在用于醇生产的淀粉水解过程中的各种使用和组合使用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用GCY1和DAK1来增加酵母的乙醇生产的组合物和方法
本专利技术的组合物和方法涉及与外源磷酸转酮酶途径组合的表达甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶多肽的酵母，并且涉及甘油脱氢酶-二羟基丙酮激酶双功能融合多肽；以及所述组合物和方法在用于醇生产的淀粉水解过程中的使用。
技术介绍
基于酵母的乙醇生产是基于糖向乙醇的转化。当前通过此方法实现的年燃料乙醇产量在世界范围内为约900亿升。据估计，乙醇生产成本的约70％是原料。因为乙醇生产量如此之大，所以甚至小的产率提升对于该产业也具有巨大的经济影响。一摩尔葡萄糖转化为两摩尔乙醇和两摩尔二氧化碳的转化是氧化还原中性的，其最大理论产率为约51％。当前的工业产率为约45％；因此，存在增加乙醇生产的机会。二氧化碳、甘油和酵母生物质是乙醇发酵的主要副产物。在酵母生长和发酵期间，生成过剩的NADH，其用于产生甘油以用于氧化还原平衡和渗透保护的目的。甘油被认为是低价值产品，并且已采用若干种方法来减少甘油产生。然而，减少甘油合成可能导致其他代谢副产物诸如乙酸的增加。乙酸是不期望的副产物，因为它不利地影响乙醇生产速率、效价和酵母发酵的产率。先前已经描述了具有异源磷酸转酮酶途径的工程化酵母细胞(例如，WO2015148272)。这些细胞表达异源磷酸转酮酶(PKL；EC4.1.2.9)和磷酸转乙酰酶(PTA；EC2.3.1.8)，任选地具有其他酶，以使碳通量远离甘油途径导向，并且朝向乙酰辅酶A的合成导向，所述乙酰辅酶A然后转化为乙醇。与在其他方面相同的亲本酵母细胞相比，这些细胞能够在发酵过程中增加乙醇生产。尽管酵母生产率有所提高，但仍需要进一步改变酵母代谢途径来最大化乙醇生产，同时不增加不期望副产物的产生。
技术实现思路
本专利技术的组合物和方法涉及与外源磷酸转酮酶途径组合的表达甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶多肽的酵母细胞，甘油脱氢酶-二羟基丙酮激酶双功能融合多肽和表达它们的酵母细胞，以及所述组合物和方法在用于醇生产的淀粉水解过程中的各种使用和组合使用。所述组合物和方法的方面和实施例描述于以下独立编号的段落中。1.在一方面，提供了一种融合多肽，该融合多肽包含与具有二羟基丙酮激酶活性的第二氨基酸序列融合的具有甘油脱氢酶活性的第一氨基酸序列，其中当在酵母细胞中表达时，所述融合多肽能够将甘油转化为二羟基丙酮磷酸盐。2.在如段落1所述的融合多肽的一些实施例中，所述第一氨基酸序列和所述第二氨基酸序列经由接头肽融合。3.在如段落1或2所述的融合多肽的一些实施例中，所述第一氨基酸序列存在于所述融合多肽的N-末端处，并且所述第二氨基酸序列存在于所述融合多肽的C-末端处。4.在如段落1或2所述的融合多肽的一些实施例中，所述第二氨基酸序列存在于融合多肽的N-末端处，并且所述第一氨基酸序列存在于所述融合多肽的C-末端处。5.在如前述段落中任一项所述的融合多肽的一些实施例中，所述第一氨基酸序列是来自酵母属物种(Saccharomycessp.)的甘油脱氢酶或其结构上或功能上的同源物。6.在如前述段落中任一项所述的融合多肽的一些实施例中，所述第二氨基酸序列是来自酵母属物种的二羟基丙酮激酶或其结构上或功能上的同源物。7.在另一方面，提供了编码如前述段落中任一项所述的融合多肽的DNA序列，与不带有所述DNA序列的亲本酵母相比，基于mRNA水平,与GCY1或DAK1之一或二者的单个表达水平相比，所述DNA序列任选地能过表达所述融合多肽。8.在另一方面，提供了包含如段落7所述的DNA序列的酵母细胞。9.在另一方面，提供了表达或过表达如段落1-8中任一项所述的融合多肽的酵母细胞。10.在如段落9所述的酵母细胞的一些实施例中，所述酵母细胞进一步包含外源磷酸转酮酶途径。11.在如段落9或10中任一项所述的酵母细胞的一些实施例中，所述酵母细胞进一步包含甘油途径和/或乙酰辅酶A途径中的改变。12.在如段落9-11中任一项所述的酵母细胞的一些实施例中，所述酵母细胞不额外地过表达具有甘油脱氢酶活性和/或二羟基丙酮激酶活性的单独多肽。13.在另一方面，提供了包含导致细胞过表达具有甘油脱氢酶活性的多肽和过表达具有二羟基丙酮激酶活性的多肽的基因修饰的经修饰的酵母细胞，并且所述经修饰的酵母细胞进一步包含外源磷酸转酮酶途径。14.在如段落13所述的经修饰的酵母细胞的一些实施例中，所述具有甘油脱氢酶活性的多肽和具有二羟基丙酮激酶活性的多肽作为能够将甘油转化为二羟基丙酮磷酸的双功能融合多肽生产。15.在如段落13或14所述的经修饰的酵母细胞的一些实施例中，与其他未经修饰的或亲本酵母相比，所述酵母产生降低量的二羟基丙酮。16.在如段落13-15中任一项所述的经修饰的酵母细胞的一些实施例中，所述的经修饰酵母细胞进一步包含甘油途径和/或乙酰辅酶A途径中的改变。17.在如段落13-16中任一项所述的经修饰的酵母的一些实施例中，所述的经修饰的酵母进一步包含编码碳水化合物加工酶的外源基因。18.在如段落13-17中任一项所述的经修饰的酵母细胞的一些实施例中，所述酵母细胞来自酵母属物种。19.在另一方面，提供了用于在碳水化合物底物发酵期间通过酵母细胞增加醇生产的方法，所述方法包括使碳水化合物底物与具有外源磷酸转酮酶途径和产生具有甘油脱氢酶活性的多肽和具有二羟基丙酮激酶活性的多肽的经修饰的酵母细胞接触，其中与不产生具有甘油脱氢酶活性的多肽和/或具有二羟基丙酮激酶活性的多肽的酵母细胞相比，所述经修饰的酵母细胞在发酵期间产生增加量的乙醇。20.在如段落19所述的方法的一些实施例中，所述经修饰的酵母细胞是如段落9-11中任一项所述的酵母细胞。21.在如段落19或20中任一项所述的方法的一些实施例中，所述具有甘油脱氢酶活性的多肽和具有二羟基丙酮激酶活性的多肽作为能够将甘油转化为二羟基丙酮磷酸的双功能融合多肽表达。22.在如段落21所述的方法的一些实施例中，所述双功能融合多肽是如段落1-6中任一项所述的融合多肽。根据包括附图的说明书，本专利技术的经修饰的细胞和方法的这些和其他方面以及实施例将是清楚的。附图说明图1是通过用EcoRI消化从质粒pTOPOII-Bluntura3-loxP-KanMX-loxP-ura3释放的2,018-bpura3-loxP-KanMX-loxP-ura3盒的图谱。图2是通过用SwaI消化从质粒pZKIIC-YL1K释放的4,776-bpGCY1-L1-DAK1表达盒的图谱。图3是通过用SwaI消化从质粒pZKIIC-YL2K释放的4,731-bpGCY1-L2-DAK1表达盒的图谱。图4是通过用SwaI消化从质粒pZKIIC-KL1Y释放的4,776-bpDAK1-L1-GCY1表达盒的图谱。图5是通过用SwaI消化从质粒pZKIIC-KL2Y释放的4,731-bpDAK1-L2-GCY1表达盒的图谱。图6是通过用Swa本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种融合多肽，所述融合多肽包含与具有二羟基丙酮激酶活性的第二氨基酸序列融合的具有甘油脱氢酶活性的第一氨基酸序列，其中当在酵母细胞中表达时，所述融合多肽能够将甘油转化为二羟基丙酮磷酸。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180306 US 62/639,1611.一种融合多肽，所述融合多肽包含与具有二羟基丙酮激酶活性的第二氨基酸序列融合的具有甘油脱氢酶活性的第一氨基酸序列，其中当在酵母细胞中表达时，所述融合多肽能够将甘油转化为二羟基丙酮磷酸。


2.如权利要求1所述的融合多肽，其中所述第一氨基酸序列和所述第二氨基酸序列经由接头肽融合。


3.如权利要求1或2所述的融合多肽，其中所述第一氨基酸序列存在于所述融合多肽的N-末端处，并且所述第二氨基酸序列存在于所述融合多肽的C-末端处。


4.如权利要求1或2所述的融合多肽，其中所述第二氨基酸序列存在于所述融合多肽的N-末端处，并且所述第一氨基酸序列存在于所述融合多肽的C-末端处。


5.如前述权利要求中任一项所述的融合多肽，其中所述第一氨基酸序列是来自酵母属物种(Saccharomycessp.)的甘油脱氢酶或其结构上或功能上的同源物。


6.如前述权利要求中任一项所述的融合多肽，其中所述第二氨基酸序列是来自酵母属物种的二羟基丙酮激酶或其结构上或功能上的同源物。


7.一种DNA序列，所述DNA序列编码如前述权利要求中任一项所述的融合多肽，与不带有所述DNA序列的亲本酵母相比，基于mRNA水平,与GCY1或DAK1之一或二者的单个表达水平相比，所述DNA序列任选地能过表达所述融合多肽。


8.酵母细胞，所述酵母细胞包含如权利要求7所述的DNA序列。


9.酵母细胞，所述酵母细胞表达或过表达如权利要求1-8中任一项所述的融合多肽。


10.如权利要求9所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞进一步包含外源磷酸转酮酶途径。


11.如权利要求9或10中任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞进一步包含在甘油途径和/或乙酰辅酶A途径中的改变。


12.如权利要求9-11中任一项所述的酵母细胞，其中所述酵...

【专利技术属性】
技术研发人员：Q·Q·朱，P·J·M·特尼森，
申请(专利权)人：丹尼斯科美国公司，
类型：发明
国别省市：美国;US