质粒成瘾系统技术方案

在一些实施方案中，本文提供了用于基于必需糖酵解基因的质粒成瘾系统的组合物和方法。在一些实施方案中，本文还提供了用于基于外膜流出蛋白的质粒成瘾系统的组合物和方法。流出蛋白的质粒成瘾系统的组合物和方法。流出蛋白的质粒成瘾系统的组合物和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】质粒成瘾系统
[0001]相关申请
[0002]本申请根据35 USC
§
119(e)要求2020年8月24日提交的美国临时申请号63/069,620和2020年10月13日提交的美国临时申请号63/091,259的权利；其中每一个的内容通过引用整体并入本文。
[0003]专利技术背景
[0004]基于核酸和基于蛋白质的产品的重组生产通常发生在宿主微生物细胞(例如，大肠杆菌细胞)中。这些细胞通常经过工程化(例如，使用基于质粒的技术)以大量生产高质量的所需产物。为了确保大量的产品，编码所需产品的质粒必须保持在宿主微生物细胞内。质粒维持通常通过将抗生素抗性基因标志物掺入质粒中来实现。然而，如果被释放，抗生素抗性基因标志物的掺入可能对环境有害，因为它可能促进生物体或病原体中抗生素抗性的出现，例如，通过水平遗传转移(HGT)的过程，通过将编码抗生素抗性基因标志物的DNA吸收和同化到它们自己的染色体中。因此，由于抗生素的过度使用以及对包含抗生素和编码抗生素抗性标志物的DNA的生物制品的监管担忧，需要无抗生素的质粒维持方法。r/>
技术实现思路
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.微生物细胞，其缺乏编码糖酵解酶的内源糖酵解基因的表达或具有降低的编码糖酵解酶的内源糖酵解基因的表达，其中所述微生物细胞包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码重组糖酵解酶的表达盒，并且其中所述微生物细胞可以在成分确定的培养基和/或复合培养基中生长。2.权利要求1的微生物细胞，其中所述微生物细胞在没有所述核酸构建体的情况下不能在所述成分确定的培养基和/或所述复合培养基中生长。3.权利要求1或2的微生物细胞，其中所述重组糖酵解酶具有与所述内源糖酵解基因相同的酶活性。4.权利要求1
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3中任一项的微生物细胞，其中所述微生物细胞的染色体DNA包含降低所述糖酵解酶表达的对所述内源基因或控制所述内源基因表达的元件的遗传修饰，任选地其中所述遗传修饰是突变、插入或缺失。5.权利要求1
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4中任一项的微生物细胞，其中所述核酸构建体是质粒、载体、粘粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体、噬菌体、病毒载体或任何其他。6.权利要求1
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5中任一项的微生物细胞，其中所述内源糖酵解基因编码己糖激酶、葡萄糖磷酸异构酶、磷酸果糖激酶、醛缩酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸甘油酸激酶、烯醇酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶或甘油醛3
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磷酸脱氢酶。7.权利要求1
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6中任一项的微生物细胞，其中所述重组糖酵解酶是己糖激酶、葡萄糖磷酸异构酶、磷酸果糖激酶、醛缩酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸甘油酸激酶、烯醇酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶或甘油醛3
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磷酸脱氢酶。8.权利要求1
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7中任一项的微生物细胞，其中所述内源糖酵解基因编码具有甘油醛3
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磷酸脱氢酶(GAPDH)活性的糖酵解酶，并且其中所述重组糖酵解酶具有GAPDH活性。9.权利要求1
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8中任一项的微生物细胞，其中所述内源糖酵解基因编码甘油醛3
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磷酸脱氢酶，并且其中所述重组糖酵解酶是甘油醛3
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磷酸脱氢酶。10.权利要求9的微生物细胞，其中所述甘油醛3
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磷酸脱氢酶包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列。11.权利要求1
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10中任一项的微生物细胞，其中所述微生物细胞是原核或真核细胞，任选地，其中所述微生物细胞是细菌细胞或酵母细胞。12.权利要求1
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11中任一项的微生物细胞，其中所述微生物细胞是大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)、毕赤酵母(P.pastoris)或里氏木霉(T.reesie)细胞。13.权利要求1
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12中任一项的微生物细胞，其中所述微生物细胞是大肠杆菌细胞，所述内源糖酵解基因是gapA，并且所述重组糖酵解酶是甘油醛3
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磷酸脱氢酶。14.权利要求1
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13中任一项的微生物细胞，其中所述复合培养基是Luria液体培养基(LB)、Terrific液体培养基、具有分解代谢物抑制的超优液体培养基(SOC培养基)或其任何衍生物。15.权利要求1
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14中任一项的微生物细胞，其中所述成分确定的培养基是Korz液体培养基、M9基本培养基或其任何衍生物。
16.权利要求1
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15中任一项的微生物细胞，其中所述核酸构建体进一步包含复制子，所述复制子包含复制起点及其控制元件。17.权利要求16的微生物细胞，其中所述复制子是细菌来源的。18.权利要求16的微生物细胞，其中所述复制子是ColE1复制子、pUC复制子或衍生自ColE1、pBR322、pUC、R6K、p15a或pSC101复制子。19.权利要求1
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18中任一项的微生物细胞，其中所述编码重组糖酵解酶的表达盒包含可操作地连接至所述重组糖酵解酶的编码序列的启动子。20.权利要求19的微生物细胞，其中所述启动子包含SEQ ID NO:1
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23中任一个所示的核酸序列。21.权利要求19的微生物细胞，其中所述启动子由SEQ ID NO:1
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23中任一个所示的核酸序列组成。22.权利要求19的微生物细胞，其中所述编码重组糖酵解酶的表达盒进一步包含在所述重组糖酵解酶的编码序列上游的初始转录序列(ITS)。23.权利要求22的微生物细胞，其中所述ITS包含SEQ ID NO:24中所示的核酸序列。24.权利要求22的微生物细胞，其中所述ITS由SEQ ID NO:24中所示的核酸序列组成。25.权利要求19
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24中任一项的微生物细胞，其中所述编码重组糖酵解酶的表达盒进一步包含5
’
UTR，所述5
’
UTR包含位于所述重组糖酵解酶的编码序列上游的核糖体结合位点(RBS)和所述重组糖酵解酶的编码序列下游的一个或多个终止子。26.权利要求25的微生物细胞，其中所述RBS包含SEQ ID NO:25
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35中任一个所示的核酸序列。27.权利要求25的微生物细胞，其中所述RBS由SEQ ID NO:25
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35中任一个所示的核酸序列组成。28.权利要求25
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27中任一项的微生物细胞，其中所述一个或多个终止子包含SEQ ID NO:36
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49中任一个所示的核酸序列。29.权利要求25
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27中任一项的微生物细胞，其中所述一个或多个终止子由SEQ ID NO:36
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49中任一个所示的核酸序列组成。30.权利要求1
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29中任一项的微生物细胞，其中所述核酸构建体进一步包含含有感兴趣的序列的表达盒，其中所述感兴趣的序列编码RNA产物、肽产物或蛋白质产物。31.权利要求30的微生物细胞，其中所述RNA产物是信使RNA、siRNA、microRNA、向导RNA、双链RNA的有义链或双链RNA的反义链。32.权利要求30或31的微生物细胞，其中所述核酸构建体包含两个包含感兴趣的序列的表达盒，其中第一表达盒包含编码双链RNA的有义链的第一感兴趣的序列，并且其中第二表达盒包含编码所述双链RNA的反义链的第二感兴趣的序列。33.权利要求30
‑
32中任一项的微生物细胞，其中所述包含感兴趣的序列的表达盒进一步包含可操作地连接至所述感兴趣的序列的启动子。34.权利要求33的微生物细胞，其中所述启动子包含SEQ ID NO:1
‑
23中任一个所示的核酸序列。35.权利要求33的微生物细胞，其中所述启动子由SEQ ID NO:1
‑
23中任一个所示的核酸序列组成。
36.权利要求30
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35中任一项的微生物细胞，其中所述包含感兴趣的序列的表达盒进一步包含选自由以下组成的组的一个或多个序列元件：启动子、初始转录序列、核糖体结合位点、限制性核酸内切酶位点和终止子。37.权利要求1
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36中任一项的微生物细胞，其中所述微生物细胞不包含抗生素抗性基因。38.质粒成瘾系统，其包含：(i)微生物细胞，其包含编码内源糖酵解酶的糖酵解基因的遗传修饰，其中所述遗传修饰降低或消除所述内源糖酵解酶的表达；和(ii)质粒，其包含编码重组糖酵解酶的表达盒；其中所述微生物细胞在不掺入所述质粒的情况下不能生长或繁殖。39.权利要求38的质粒成瘾系统，其中所述遗传修饰包含所述糖酵解基因或所述糖酵解基因的控制元件内的突变、插入或缺失，任选地，其中所述控制元件是启动子或核糖体结合位点。40.权利要求38或39的质粒成瘾系统，其中所述重组糖酵解酶具有与所述内源糖酵解酶相同的酶活性。41.权利要求38
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40中任一项的质粒成瘾系统，其中如果将所述质粒掺入所述细胞中，则所述微生物细胞可以在成分确定的培养基和/或复合培养基中生长。42.权利要求38
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41中任一项的质粒成瘾系统，其中所述修饰的糖酵解基因编码己糖激酶、葡萄糖磷酸异构酶、磷酸果糖激酶、醛缩酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸甘油酸激酶、烯醇酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶或甘油醛3
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磷酸脱氢酶。43.权利要求38
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42中任一项的质粒成瘾系统，其中所述重组糖酵解酶是己糖激酶、葡萄糖磷酸异构酶、磷酸果糖激酶、醛缩酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸甘油酸激酶、烯醇酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶或甘油醛3
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磷酸脱氢酶。44.权利要求38
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43中任一项的质粒成瘾系统，其中所述经修饰的糖酵解基因编码具有甘油醛3
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磷酸脱氢酶(GAPDH)活性的糖酵解酶，并且其中所述重组糖酵解酶具有GAPDH活性。45.权利要求38
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44中任一项的质粒成瘾系统，其中所述经修饰的糖酵解基因编码甘油醛3
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磷酸脱氢酶，并且其中所述重组糖酵解酶是甘油醛3
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磷酸脱氢酶。46.权利要求45的质粒成瘾系统，其中所述甘油醛3
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磷酸脱氢酶包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列。47.权利要求38
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46中任一项的质粒成瘾系统，其中所述微生物细胞是原核或真核细胞，任选地，其中所述微生物细胞是细菌细胞或酵母细胞。48.权利要求38
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46中任一项的质粒成瘾系统，其中所述微生物细胞是大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、酿酒酵母、解脂耶氏酵母、毕赤酵母或里氏木霉细胞。49.权利要求38
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48中任一项的质粒成瘾系统，其中所述微生物细胞是大肠杆菌细胞，失活的糖酵解基因是gapA，并且所述重组糖酵解酶是甘油醛3
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磷酸脱氢酶。50.权利要求41
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49中任一项的质粒成瘾系统，其中所述复合培养基是Luria液体培养基(LB)、Terrific液体培养基、具有分解代谢物抑制的超优液体培养基(SOC培养基)或其任
何衍生物。51.权利要求41
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50中任一项的质粒成瘾系统，其中所述成分确定的培养基是Korz液体培养基、M9基本培养基或其任何衍生物。52.权利要求41
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51中任一项的质粒成瘾系统，其中所述质粒包含复制子，所述复制子包含复制起点及其允许所述质粒在所述微生物细胞中复制的控制元件，任选地其中所述复制子是ColE1复制子，pUC复制子或衍生自ColE1、pUC、pBR322、R6K、p15a或pSC101复制子。53.权利要求41
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52中任一项的质粒成瘾系统，其中所述编码重组糖酵解酶的表达盒包含可操作地连接至所述重组糖酵解酶的编码序列的启动子。54.权利要求53的质粒成瘾系统，其中所述启动子包含SEQ ID NO:1
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23中任一个所示的核酸序列。55.权利要求53的质粒成瘾系统，其中所述启动子由SEQ ID NO:1
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23中任一个所示的核酸序列组成。56.权利要求53
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55的质粒成瘾系统，其中编码所述重组糖酵解酶的表达盒进一步包含所述重组糖酵解酶的编码序列上游的初始转录序列(ITS)。57.权利要求56的质粒成瘾系统，其中所述ITS包含SEQ ID NO:24所示的核酸序列。58.权利要求56的质粒成瘾系统，其中所述ITS由SEQ ID NO:24所示的核酸序列组成。59.权利要求53
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58中任一项的质粒成瘾系统，其中编码重组糖酵解酶的表达盒进一步包含5
’
UTR，所述5
’
UTR包含位于所述重组糖酵解酶的编码序列上游的核糖体结合位点(RBS)和所述重组糖酵解酶的编码序列下游的一个或多个终止子。60.权利要求59的质粒成瘾系统，其中所述RBS包含SEQ ID NO:25
‑
35中任一个所示的核酸序列。61.权利要求59的质粒成瘾系统，其中所述RBS由SEQ ID NO:25
‑
35中任一个所示的核酸序列组成。62.权利要求59
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61中任一项的质粒成瘾系统，其中所述一个或多个终止子包含SEQ ID NO:36
‑
49中任一项所示的...

【专利技术属性】
技术研发人员：H，
申请(专利权)人：绿光生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：