信使RNA的大规模合成制造技术

本发明专利技术尤其提供了用于大规模产生包含基本上不含双链RNA的全长信使RNA产物的组合物的方法以及使用此类方法产生的组合物及其用途。本发明专利技术部分地基于以下令人惊奇的发现：使用SP6RNA聚合酶通过体外转录产生的mRNA产物基本上不含双链RNA。在一方面，本发明专利技术提供了大规模产生用于mRNA疗法而不需要色谱步骤的mRNA产物的方法。mRNA产物的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】信使RNA的大规模合成
相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求2020年10月15日提交的美国临时申请号63/092,274的权益，将所述临时申请的全部公开内容通过引用特此并入。

技术介绍

[0002]信使RNA(mRNA)疗法正在变成越来越重要的用于治疗多种疾病的方法。mRNA疗法包括将包含体外转录(IVT)且高纯度的信使RNA(mRNA)的药品施用于需要疗法的患者，以及在患者体内产生由mRNA编码的蛋白质。
[0003]通过体外转录产生mRNA还产生双链RNA(dsRNA)，其是mRNA产物中的主要污染物，这对于mRNA疗法将是不可接受的。双链RNA是不期望的，因为它导致所施用的mRNA产物的低效翻译并导致细胞因子的诱导，触发免疫应答。
[0004]传统上，使用可商购的色谱系统和/或通过提取至有机混合物(苯酚:氯仿:异戊醇)中并随后进行乙醇沉淀来纯化通过体外转录产生的mRNA。然而，dsRNA杂质不能通过标准纯化方法有效地去除，所述标准纯化方法包括基于氯化锂或醇的沉淀、尺寸排阻和离子交换色谱法、或基于二氧化硅基质的纯化。
[0005]dsRNA杂质仅能通过需要特殊仪器并产生有害废物的程序来去除。目前，离子对反相高效液相色谱法(HPLC)是用于从长IVT mRNA中消除dsRNA污染物的方法。然而，这种方法昂贵、不可放大，并且采用有毒的乙腈。

技术实现思路

[0005]需要用于产生适合于mRNA治疗学的没有污染性双链RNA(dsRNA)的高纯度mRNA产物的有成本效益的大规模合成方法。本专利技术尤其提供了一种产生没有或基本上不含污染性dsRNA的mRNA的大规模体外合成方法。本专利技术尤其提供了一种使用SP6RNA聚合酶产生mRNA产物而不需要合成后纯化步骤来去除污染性dsRNA的方法，所述合成后纯化步骤诸如色谱方法(例如，离子对反相高效液相色谱法或尺寸排阻和离子交换色谱法)。
[0006]本专利技术部分地基于以下令人惊奇的发现：与其他RNA聚合酶(如T7 RNA聚合酶)相比，SP6 RNA聚合酶合成具有显著减少的dsRNA的全长mRNA。如下文(包括实施例章节)更详细地所述，与通过T7 RNA聚合酶合成的mRNA产物相比，通过SP6 RNA聚合酶合成的mRNA产物是高产的，并且基本上不含dsRNA。通过SP6 RNA聚合酶经由IVT产生的mRNA产物不仅富含具有显著减少的流产性转录物的全长mRNA，而且具有令人惊奇且出乎意料的基本上不含dsRNA的特性。SP6 RNA聚合酶的这些独特且有利的特性产生了与由T7 RNA聚合酶产生的mRNA产物相比质量明显更高、适合于mRNA治疗学的mRNA产物。因此，本专利技术部分地提供了一种体外合成mRNA而不需要合成后纯化方法来去除dsRNA的方法，所述合成后纯化方法包括例如色谱方法(例如，上文和
技术介绍
中提及的那些)。
[0007]如果需要，可以例如通过可以用1克或更多的体外合成的mRNA批次操作的基于沉淀和过滤的方法纯化通过本专利技术方法产生的体外合成的mRNA以去除源自体外合成反应的
污染物(如在该反应中使用的一种或多种酶)。此类方法可以包括例如切向流过滤、深度过滤或离心(例如，使用过滤离心机)。合适的方法描述于例如WO 2015/164773、WO 2018/157141和WO 2020/041793中。
[0008]在一方面，本专利技术提供了一种大规模产生包含全长信使RNA(mRNA)的组合物的方法，所述方法包括使用SP6 RNA聚合酶体外合成mRNA，其中以单个批次合成至少1克(1g)mRNA，并且其中所述组合物含有按重量计小于1％的双链RNA(dsRNA)。
[0009]在一些实施方案中，所述方法不包括色谱步骤。
[0010]在一些实施方案中，整个方法在非变性条件下进行。在一些实施方案中，在非变性条件下合成所述mRNA。
[0011]在一方面，本专利技术提供了一种产生包含全长信使RNA(mRNA)的组合物的方法，所述方法包括体外合成mRNA，其中所述组合物含有按重量计小于1％的双链RNA(dsRNA)，并且其中所述方法不包括色谱步骤。
[0012]在一方面，本专利技术提供了一种产生包含全长信使RNA(mRNA)的组合物的方法，所述方法包括体外合成mRNA，其中所述组合物含有按重量计小于1％的双链RNA(dsRNA)，并且其中在非变性条件下合成所述mRNA。
[0013]在一些实施方案中，所述方法包括体外合成mRNA，其中以单个批次合成至少1g mRNA。
[0014]在一些实施方案中，所述方法包括体外合成mRNA，其中以所述单个批次合成至少10g、100g、250g、500g、1kg或10kg mRNA。因此，在一些实施方案中，所述方法包括体外合成mRNA，其中合成至少10g mRNA。在一些实施方案中，在一些实施方案中，所述方法包括体外合成mRNA，其中合成至少100g mRNA。在一些实施方案中，在一些实施方案中，所述方法包括体外合成mRNA，其中合成至少500g mRNA。在一些实施方案中，在一些实施方案中，所述方法包括体外合成mRNA，其中合成至少1kg mRNA。在一些实施方案中，在一些实施方案中，所述方法包括体外合成mRNA，其中合成至少10kg mRNA。在一些实施方案中，所述方法包括体外合成mRNA，其中以单个批次合成超过10kg mRNA。例如，在一些实施方案中，以单个批次合成25kg、50kg、75kg、100kg或更多的体外合成的mRNA。
[0015]在一些实施方案中，所述方法包括体外合成mRNA，其中所述组合物含有按重量计小于0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.05％、0.01％的所述dsRNA。
[0016]在一些实施方案中，所述方法包括体外合成mRNA，其中所述组合物基本上不含所述dsRNA。
[0017]在一些实施方案中，所述方法包括体外合成mRNA，其中mRNA的体外合成在约6至8.5之间、约6.5至8.0之间或约7.0至7.5之间的pH下进行。在特定的实施方案中，mRNA的体外合成在7.5与7.7之间的pH下进行。在一些实施方案中，所述pH是6、6.2、6.4、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2或8.4。在一些实施方案中，所述pH是7.5。在一些实施方案中，所述pH是7.7。
[0018]在一些实施方案中，所述方法包括体外合成mRNA，其中mRNA的体外合成在包含25mM tris HCl、2mM亚精胺、25mM MgCl、0.5mM NaCl和pH 7.5的缓冲液中进行。
[0019]在一些实施方案中，所述方法包括体外合成mRNA，其中所述方法不包括离液剂。离
液剂是通过干扰非共价力(如氢键和范德华力)破坏大分子(如蛋白质和核酸)的结构的物质。在一些实施方案中，离液剂包括例如脲、硫脲、盐酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍、乙酸锂、氯化镁、十二烷基硫酸钠、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种大规模产生包含全长信使RNA(mRNA)的组合物的方法，所述方法包括使用SP6 RNA聚合酶体外合成mRNA，其中以单个批次合成至少1g mRNA，并且其中所述组合物含有按重量计小于1％的双链RNA(dsRNA)。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法不包括色谱步骤。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在非变性条件下合成所述mRNA。4.一种产生包含全长信使RNA(mRNA)的组合物的方法，所述方法包括体外合成mRNA，其中所述组合物含有按重量计小于1％的双链RNA(dsRNA)，并且其中所述方法不包括色谱步骤。5.一种产生包含全长信使RNA(mRNA)的组合物的方法，所述方法包括体外合成mRNA，其中所述组合物含有按重量计小于1％的双链RNA(dsRNA)，并且其中在非变性条件下合成所述mRNA。6.根据权利要求4或5所述的方法，其中以单个批次合成至少1g mRNA。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中以所述单个批次合成至少10g、100g、250g、500g、1kg或10kg mRNA。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组合物含有按重量计小于0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.05％、0.01％的所述dsRNA。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述组合物基本上不含所述dsRNA。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中mRNA的所述体外合成在约6至8.5之间的pH下进行。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中mRNA的所述体外合成在包含25mM tris HCl、2mM亚精胺、25mM MgCl、0.5mM NaCl和pH 7.5的缓冲液中进行。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法不包括离液剂。13.一种大规模产生包含全长信使RNA(mRNA)的组合物的方法，所述方法包括使用SP6 RNA聚合酶体外合成mRNA，其中所述组合物包含按重量计小于1％的双链RNA(dsRNA)，并且其中以单个批次合成至少100mg mRNA。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述组合物含有按重量计小于0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.05％、0.01％的所述dsRNA。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述组合物基本上不含所述dsRNA。16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过斑点印迹测定或ELISA检测所述dsRNA。17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在为所述合成的mRNA加帽或加尾之前对所述dsRNA进行检测。18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括为所述合成的mRNA加帽和/或加尾的步骤。19.根据权利要求1
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16中任一项所述的方法，其中在为所述合成的mRNA加帽和加尾之后对所述dsRNA进行检测。20.根据权利要求13
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19中任一项所述的方法，其中以单个批次合成至少200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1g、5g、10g、25g、50g、75g、100g、150g、200g、250g、500g、750g、1kg、5kg或10kg或更多的mRNA。
21.根据权利要求13
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20中任一项所述的方法，其中所述方法不包括特意去除所述dsRNA的步骤。22.根据权利要求13
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21中任一项所述的方法，其中所述方法不包括色谱步骤。23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述SP6 RNA聚合酶是天然存在的SP6 RNA聚合酶。24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述SP6 RNA聚合酶是重组SP6 RNA聚合酶。25.根据权利要求24所述的方法，其中所述SP6 RNA聚合酶包含标签。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述标签是his标签。27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中基于DNA模板通过所述SP6 RNA聚合酶合成所述mRNA。28.根据权利要求27所述的方法，其中反应混合物中SP6 RNA聚合酶的按重量计的量等于或大于DNA模板的按重量计的量。29.根据权利要求28所述的方法，其中DNA模板与SP6 RNA聚合酶的重量比在1:1与1:3之间。30.根据权利要求27至29中任一项所述的方法，其中所述DNA模板包含可操作地连接至编码待合成的mRNA序列的DNA序列的SP6启动子。31.根据权利要求30所述的方法，其中所述DNA序列是经优化的。32.根据权利要求31所述的方法，其中所述DNA序列经优化以降低在所述合成的mRNA中形成发夹结构的可能性。33.根据前述权利要求中任一项所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：翻译生物公司，
类型：发明
国别省市：