一种用于荧光探针法qPCR的热启动B族DNA聚合酶及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种用于荧光探针法qPCR的热启动B族DNA聚合酶及其制备方法与应用。本发明专利技术KOFU

【技术实现步骤摘要】
一种用于荧光探针法qPCR的热启动B族DNA聚合酶及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于荧光探针法qPCR的热启动B族DNA聚合酶及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]1983年Mullis等人专利技术聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)，以极少量的DNA分子为模板，即可以指数扩增的形式产生大量靶标，以其高特异性、高灵敏性、操作简便、成本低廉等优点，已扩展到医学检验、农业科学、环境科学、食品安全等众多领域。随着PCR技术的发展，衍生出了多种基于PCR方法的新技术，比如：多重PCR、荧光定量PCR和数字PCR等。其中，实时荧光定量PCR技术(Real
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time quantitative PCR，qPCR)是在PCR技术的基础上，引入荧光物质，将扩增产物转换为荧光信号，实时检测扩增情况，弥补了传统PCR只能采用终点法观察及无法定量分析产物的缺陷。
[0003]直扩qPCR技术的提出，使快速、精准检测成为可能。该技术相比于传统的qPCR技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于荧光探针法qPCR的热启动B族DNA聚合酶，其特征在于：命名为KOFU
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mut，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.编码权利要求1中所述的KOFU
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mut的DNA分子，其特征在于：所述的DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。3.含有权利要求2中所述的DNA分子的重组表达载体或重组工程细胞株。4.权利要求1中所述的KOFU
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mut的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：1)取权利要求3中所述的重组工程细胞株，接种于LB培养基中，培养，得到种子液；2)取所得种子液接种于LB培养基中，培养，得到菌液；3)向所得菌液中加入IPTG至终浓度为0.025～0.4mmol/L，诱导细胞表达蛋白，离心收集菌体沉淀；4)向所得菌体沉淀中加入裂解缓冲液重悬菌体，超声破碎菌体，离心取上清液；5)所得上清液75℃孵育20～30min，冰浴10～20min，离心取上清液，0.22μm微孔滤膜过滤；6)进行镍离子亲和层析，蛋白变性电泳检测各个梯度下洗脱产物，收集含有目的蛋白的样品；7)进行强阴离子交换纯化，蛋白变性电泳检测各个梯度下洗脱产物，收集含有目的蛋白的样品，即获得所述的KOFU
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mut；其中，步骤1)和步骤2)中所述的LB培养基均含50μg/mL硫酸卡那霉素；步骤1)中所述的培养的条件为37℃，150～200r/min振荡培养；步骤2)中所述的培养的条件为37℃，150～200r/min振荡培养至OD
600
＝0.6～0.8；步骤2)中所述的种子液按1:100的体积比接种于LB培养基；步骤3)中所述的诱导的条件为25℃诱导10～12h；步骤3)所述的离心的条件为4℃以20000
×
g的转速离心20～30min；步骤4)中所述的裂解缓冲液的用量按每克菌体沉淀中加入5mL计；步骤4)中所述的超声的条件为功率250W，超声5.5s，间隔5.5s，持续30min；步骤4)和步骤5)中中所述的离心的条件为4℃以20000
×
g的转速离心10～20min；步骤4)中所述的裂解缓冲液的组分为：50mmol/L Tris
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HCl、50mmol/L NaCl、5％v/v甘油，pH8.0；步骤6)中所述的镍离子亲和层析和强阴离子交换层析所用的结合缓冲液的组分为：50mmol/L Tris
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HCl、50mmol/L NaCl、5％v/v甘油，pH 8.0；镍离子亲和层析所用的洗脱缓冲液的组分为：50mmol/L Tris
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HCl、50mmol/L NaCl、500mmol/L咪唑、5％v/v甘油，pH 8.0；强阴离子交换层析所用的洗脱缓冲液的组分为：所用的洗脱缓冲液的组分为：50mmol/L Tris
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HCl、1mol/L NaCl、5％v/v甘油，pH8.0。5.一种热启动DNA聚合酶，其特征在于：是权利要求1中所述的KOFU
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mut的聚合酶活性位点赖氨酸侧链氨基上经特异性结合酸酐类化合物得到；所述的酸酐类化合物为马来酸酐或柠康酸酐。6.权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡松青，王艳茹，刘光毅，侯轶，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：