一种基于蛋白定向进化的快速逆转录酶及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于蛋白定向进化的快速逆转录酶及其应用，涉及体外检测生物技术领域领域。本发明专利技术首次针对快速扩增效果对野生型M

【技术实现步骤摘要】
一种基于蛋白定向进化的快速逆转录酶及其应用


[0001]本专利技术涉及体外检测生物
，尤其涉及一种基于蛋白定向进化的快速逆转录酶及其应用。

技术介绍

[0002]逆转录酶是一种RNA依耐性的DNA聚合酶，上个世纪70年代在RNA病毒中发现的，它可以将RNA逆转录生成互补DNA链(cDNA)的酶。目前应用最广泛的逆转录酶来源于莫洛泥鼠白血病病毒(Moloney Murine LeukemiaVirus,M
‑
MLV)，常用于cDNA文库构建、mRNA测序、RT
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PCR定量等，被广泛应用于科学研究及医学分子诊断领域。
[0003]尤其是在分子诊断领域，逆转录结合常规荧光定量PCR，也称为RT
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qPCR，广泛的应用于RNA病毒的检测诊断。目前核酸检测的趋势是检测时间越快越好，除了快速PCR过程以外，还可以通过缩短逆转录的时间来达到快速检测的目的。常规的逆转录时间为15min，如果能缩短到1
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2min，将可大幅缩短检测时间，增加检测通量，提高检测效率。但是，RNA合成的速度通常和逆转录酶对RNA模板的亲和力有关，高合成速度通常意味着更高的亲和力，而高亲和力往往意味着对抑制剂的高耐受力。
[0004]亟需尽早开发出对RNA模板具有高亲和力且耐杂质的逆转录酶，缩短核酸检测时间。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是现有的逆转录酶对RNA模板的亲和力较低，逆转录时间长。
[0006]为了解决上述问题，本专利技术提出以下技术方案：
[0007]第一方面，本专利技术提供一种基于蛋白定向进化的快速逆转录酶，由野生型M
‑
MLV逆转录酶(GenBank:AF462057.1)的氨基酸序列第204位、第221位、第223位、第249位、第259位、第302位、第309位、第311位、第330位、第358位、第391位、第435位、第491位、第524位和第583位中的至少两个位点进行定点突变获得，且与野生型M
‑
MLV逆转录酶的氨基酸序列具有96％以上同一性，优选97％以上同一性，更优选99％以上同一性，并具有M
‑
MLV逆转录酶活性。
[0008]野生型M
‑
MLV逆转录酶(GenBank:AF462057.1)的核苷酸序列如SEQ ID NO：25所示。
[0009]进一步地，所述的基于蛋白定向进化的快速逆转录酶，由野生型M
‑
MLV逆转录酶的氨基酸序列第204位、第221位、第223位、第249位、第259位、第302位、第309位、第311位、第330位、第358位、第391位、第435位、第491位、第524位和第583位中的任意两个位点进行定点突变获得，且与野生型M
‑
MLV逆转录酶的氨基酸序列具有96％以上同一性，优选97％以上同一性，更优选99％以上同一性，并具有M
‑
MLV逆转录酶活性。
[0010]进一步地，将上述各取代用三联体表示：字母
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数字
‑
字母，其中数字表示突变氨基
酸的位置，数字前的字母对应突变涉及的氨基酸，数字后的字母表示用于置换数字前氨基酸的氨基酸L221Q、L204H、Y223V、G249N、K259A、K259T、R302E、G309F、C311R、Q330K、Q330T、L358G、R391P、I435L、G491L、T524G、T583D。
[0011]进一步地，所述的基于蛋白定向进化的快速逆转录酶，包括如SEQ ID NO：1
‑
12任一项所示的氨基酸序列，或与所示序列具有98％以上同一性，更优选99％以上同一性的具有M
‑
MLV逆转录酶活性的氨基酸序列。
[0012]第二方面，本专利技术提供编码所述的基于蛋白定向进化的快速逆转录酶的核苷酸序列，与SEQ ID NO：1
‑
12任一项所示的氨基酸序列对应。
[0013]进一步地，所述的基于蛋白定向进化的快速逆转录酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：13
‑
24任一项所示。
[0014]第三方面，本专利技术提供一种重组表达载体，所述载体包含第二方面所述的核苷酸序列。
[0015]第四方面，本专利技术提供一种重组细胞，所述重组细胞表达第一方面所述的基于蛋白定向进化的快速逆转录酶、或包含第三方面所述的重组表达载体。
[0016]第五方面，本专利技术提供一种逆转录试剂盒，所述试剂盒含有第一方面所述的基于蛋白定向进化的快速逆转录酶。
[0017]第六方面，本专利技术提供一种筛选第一方面所述的基于蛋白定向进化的快速逆转录酶的方法，包括如下步骤：
[0018]S1、对模板野生型M
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MLV酶质粒进行随机突变与组合突变，得到突变的基因文库；其中，随机突变的每个克隆至少含有两个活性位点的突变；
[0019]S2、对S1得到的基因文库构建到文库质粒上，与构建好的I
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Scel质粒按1：1电转到大肠杆菌细胞中，诱导I
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Scel内切酶表达以切除带有相应酶切位点的M
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MLV突变体表达质粒DNA，再将表达M
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MLV突变体的大肠杆菌细胞进行油滴包裹后用溶菌酶处理，加入RT
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PCR体系后
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80℃反复冻融三次以上以彻底裂解细胞后进行多次高通量筛选，得到M
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MLV突变体转化子；
[0020]S3、将最后一轮高通量筛选得到的转化子进行表达纯化；
[0021]S4、将纯化得到的M
‑
MLV逆转录酶用酶保存液稀释至不同浓度，测定不同稀释梯度的逆转录酶性能以确定酶的最佳稀释度；再用不同的引物探针鉴定M
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MLV突变体逆转录酶快速逆转录的性能，记录不同逆转录时间，不同引物探针下的Ct值；
[0022]S5、筛选出第一方面所述的基于蛋白定向进化的快速逆转录酶。
[0023]具体地，本专利技术中，步骤S1的随机突变主要通过易错PCR体系进行。通过改变传统PCR体系的dNTPs，Mg
2+
浓度，Mn
2+
浓度，PH值或用低保真的Taq酶增加PCR的错配率从而得到序列多样性文库。本专利技术的易错PCR采用了商业试剂盒Takara的PCR Random Mutagenesis Kit User Manual进行随机突变，每个克隆至少含有两个位点突变。易错PCR的体系见表1，引物序列见表2，PCR程序见表3。
[0024]表1:
[0025] Volumes by Buffer Condition(μl)PCR Grade Water37
10X TITANIUM Taq Buffer5MnSO4(8mM)3dGTP(本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于蛋白定向进化的快速逆转录酶，其特征在于，由野生型M
‑
MLV逆转录酶的氨基酸序列第204位、第221位、第223位、第249位、第259位、第302位、第309位、第311位、第330位、第358位、第391位、第435位、第491位、第524位和第583位中的至少两个位点进行定点突变获得，且与野生型M
‑
MLV逆转录酶的氨基酸序列具有96％以上同一性并具有M
‑
MLV逆转录酶活性。2.如权利要求1所述的基于蛋白定向进化的快速逆转录酶，其特征在于，由野生型M
‑
MLV逆转录酶的氨基酸序列第204位、第221位、第223位、第249位、第259位、第302位、第309位、第311位、第330位、第358位、第391位、第435位、第491位、第524位和第583位中的任意两个位点进行定点突变获得，且与野生型M
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MLV逆转录酶的氨基酸序列具有97％以上同一性并具有M
‑
MLV逆转录酶活性。3.如权利要求2所述的基于蛋白定向进化的快速逆转录酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1
‑
12任一项所示，或与所示序列具有98％以上同一性的具有M
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MLV逆转录酶活性的氨基酸序列。4.编码如权利要求3所述的基于蛋白定向进化的快速逆转录酶的核苷酸序列。5.编码如权利要求3所述的基于蛋白定向进化的快速逆转录酶的核苷酸序列，其特征在于，如SEQ ID NO：13
‑
24任一项所示。6.一种重组表达载体，其特征在于，所述载体包含权利要求4或5中所述的核苷酸序列。7.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞表达权利要求1
‑
3任一项所述的基于蛋白定向进化的快速逆转录酶、或包含权利要求6所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢宝，胡利华，李泓彦，王华英，李琦，孙国庆，
申请(专利权)人：深圳市艾伟迪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：