一种抗镰刀型细胞贫血症血红蛋白单链抗体的制备及其应用制造技术

本申请涉及疾病检测技术领域，尤其涉及一种抗镰刀型细胞贫血症血红蛋白单链抗体的制备方法；所述单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述单链抗体包括包含重链可变区和轻链可变区；所述单链抗体重组蛋白涉及采用大肠杆菌表达技术表达与蛋白纯化；本申请所述单链抗体具有较高的特异性，其编码氨基酸序列的蛋白仅能特异性地结合突变体血红蛋白HbβE6V重组蛋白，而对野生型血红蛋白HbβWT重组蛋白无相互结合作用。所述单链抗体可应用于镰刀型细胞贫血症的疾病诊断，具有广泛的应用前景。具有广泛的应用前景。具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种抗镰刀型细胞贫血症血红蛋白单链抗体的制备及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医药领域和基因工程抗体
，具体涉及一种用于检测抗镰刀型细胞贫血症血红蛋白单链抗体制备方法和应用。

技术介绍

[0002]镰刀型细胞贫血病又称镰刀状细胞型贫血、镰状细胞贫血，是一种常染色体隐性遗传血红蛋白病，因β
‑
肽链第6位氨基酸谷氨酸被缬氨酸所代替，构成镰状血红蛋白，取代了正常血红蛋白。临床表现为慢性溶血性贫血、易感染和再发性疼痛危象引起慢性局部缺血从而导致器官组织损害。主要通过输血、药物治疗等方法进行治疗。纯合子患者预后较差，杂合子患者预后相对较好。，镰刀型细胞贫血病被收录在国家卫生健康委员会等5部门联合制定了《第一批罕见病目录》中。免疫学快速检测方法可加快人群在该病的诊断，这需要特异性高的血红蛋白突变体HbβE6V抗体。
[0003]单链抗体(single chain antibody fragment，scFv)的开发成为近年来的基于免疫学方法的抗体原料的重要来源之一。scFV,也称单链可变片段，实际上不是抗体的片段，而是免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区通过短链接肽(linker)连接而成的融合蛋白，linker一般为十至二十五个氨基酸的短肽。这种蛋白质可能通过人源抗体文库结合噬菌体展示技术获得相应序列信息。它保留了原始免疫球蛋白的特异性，与抗原结合结构域表达为单个肽结合。与哺乳动物细胞培养产生的单克隆抗体不同，scFv可以利用细菌细胞培养方式产生，如大肠杆菌表达系统。
[0004]针对的血红蛋白突变体HbβE6V蛋白的单链抗体没有相关报道，本专利技术通过特定人源单链抗体scFV文库结合噬菌体展示技术，筛选并鉴定出抗血红蛋白突变体HbβE6V蛋白的单链抗体，为镰刀型细胞贫血症的疾病诊断提供了一种新的原料。

技术实现思路

[0005]鉴于上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供抗镰刀型细胞贫血症血红蛋白单链抗体的制备及其应用，旨在解决现有技术中缺少抗镰刀型细胞贫血症血红蛋白单链抗体的问题。
[0006]本专利技术的技术方案如下：通过特定人源单链抗体scFV文库结合噬菌体展示技术，筛选相对应的针对血红蛋白突变体HbβE6V蛋白的噬菌体。接着，通过基因克隆、原核表达载体构建和蛋白纯化等技术获得抗HbβE6V蛋白的scFV。利用DNA测序技术分析出scFV的序列信息。根据大肠杆菌的偏好密码子特性优化编码密码子人工合成用于基因工程菌表达的编码scFV的DNA序列，并将该DNA序列与大肠杆菌表达载体pET
‑
His
‑
DsbA构建出重组表达质粒DNA。利用大肠杆菌表达系统诱导表达目的蛋白，使用Ni
‑
NTA层析柱纯化重组scFV蛋白，将其进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS
‑
PAGE)分析。最后，蛋白免疫印迹方法检测该scFV对血红蛋白野生型HbβWT和突变体HbβE6V重组蛋白的结合能力。
[0007]所述包括一种用于检测突变体Hb E6V蛋白的单链抗体，其特征在于，所述单链抗
体包括包含重链可变区和轻链可变区；
[0008]所述包括一种蛋白质序列，蛋白质序列氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0009]所述包括一种重组蛋白表达方案，包括：构建重组工程菌:将所述单链抗体核苷酸序列重组至原核表达载体中，构建获得表达所述单链抗体的重组表达质粒，将所述重组表达质粒导入基因工程菌中构建重组工程菌；单链抗体的表达:将得到的重组工程菌进行诱导培养，获得所述单链抗体并纯化。
[0010]所述包括一种检测突变体Hb E6V蛋白的试剂盒，如酶联免疫吸附试验(ELISA)。
[0011]所述包括重组单链抗体蛋白在制备镰刀型细胞贫血症血红蛋白Hb E6V快速检测产品中的应用，如胶体金免疫层析法。
附图说明
[0012]图1为本专利技术实施例提供的单链抗体噬菌体的ELISA检测结果图
[0013]图2为本专利技术实施例提供的特异性单链抗体基因的基因扩增图
[0014]图3为本专利技术实施例提供的特异性单链抗体的氨基酸与优化密码子序列图
[0015]图4为本专利技术实施例提供的特异性单链抗体基因的重组蛋白方案、表达与纯化图
[0016]图5为本专利技术实施例提供的特异性单链抗体的活性检测图
具体实施方式
[0017]本专利技术提供一种抗镰刀型细胞贫血症血红蛋白单链抗体的制备及其应用，为使本专利技术的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本专利技术进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0018]如无特别说明，实施例中所用的试剂、材料等全部来自于市售。
[0019]实施例1靶向HbβE6V重组蛋白的抗体噬菌体的筛选
[0020]单链抗体库的扩增取微量抗体库液添加到含有100mg/mL氨苄青霉素和1％葡萄糖的2
×
TY
‑
AG培养基，37℃培养至OD
600
值达0.4。加入噬菌体M13，37℃培养半小时后离心收集沉淀。再用50mL 2
×
TY
‑
AG培养基重悬，30℃培养过夜。第2天将培养物离心取上清，加入1/5体积PEG/NaCl溶液(20％PEG6000，2.5mol/L NaCl)静置1～4小时。10000g离心10分钟收集沉淀噬菌体，用5Ml PBS溶液重悬。富集筛选HbβE6V重组蛋白的单链抗体用500ng重组蛋白HbβE6V的PBS悬液包被免疫管，4℃过夜，用PBS清洗试管3次。用2％脱脂奶粉的PBS溶液室温封闭2小时。用PBS清洗后，加入10
12
pfu噬菌体展示单链抗体文库，37℃温育2小时。用含0.1％吐温20的PBS洗涤。用1mL 0.2mol/L甘氨酸/盐酸缓冲液(pH 2.0)洗脱特异性结合的噬菌体，加入1mol/L Tris溶液(pH9.0)中和反应。用该噬菌体感染E.coli TG1,37℃静置半小时。分别取1，1：10，1：100，1：1000，1：10000等稀释比例TG1直接布于含100mg/L氨苄青霉素的TYE培养基平板。取单克隆菌落到100mg/L氨苄青霉素的TYE培养基扩增。将再进行2次富集筛选工作。
[0021]ELISA检测取50μL上述细菌的上清液进行ELISA检测。用200ng/孔HbβE6V重组蛋白包板，用2％脱脂奶粉封闭2小时，加入50μL上述上清液37℃孵育2小时，PBS清洗后加入辣根过氧化物酶耦联的鼠抗M13抗体孵育1小时，加入TMB底物显色，显色后加入2mol/L硫酸中止反应。用酶标仪测量OD
450
值。
[0022]如表1所示，经过抗原结合方法可以富集筛选到靶向HbβE6V重组蛋白的抗体噬菌体。经过ELISA方法检测发现三株阳性克隆的OD值明显高于阴性克隆株(N株)(P＜0.05)，其中A5株与rHbβW本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测突变体HbE6V蛋白的单链抗体，其特征在于，所述单链抗体包括包含重链可变区和轻链可变区。2.一种蛋白质序列，其特征在于，所述蛋白质序列为权利要求1中任一项所述的单链抗体，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。3.一种重组蛋白表达方案，其特征在于，所述重组蛋白表达方案包含权利要求1～2中任一项所述的单链抗体。4.权利要求1所述的一种用于检测HbE6V蛋白的单链抗体的制备方法，其特征在于，包括：构建重组工程菌:将所述单链抗体核苷酸序列重组至原核表达载...

【专利技术属性】
技术研发人员：范海艳，李泓彦，胡利华，李梦凡，山云，
申请(专利权)人：深圳市艾伟迪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：