一种抗HbA1c的纳米抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及抗体制备技术领域，尤其涉及一种抗HbA1c的纳米抗体及其制备方法和应用，其制备方法包括以下步骤：S1、构建纳米抗体噬菌体展示文库；S2、基于所述纳米抗体噬菌体展示文库进行HbA1c纳米抗体的筛选以及原核表达验证；步骤S1包括如下步骤：制备高活性免疫抗原并免疫目的动物；分离所述目的动物的外周血淋巴细胞提取RNA，经过反转录获得cDNA；以所述cDNA为模板进行两轮PCR扩增获得纳米抗体片段，再将所述纳米抗体片段与展示载体连接，构建纳米抗体基因文库以及纳米抗体展示文库。本发明专利技术所制得的抗体具有高度特异的抗原识别能力，具有高度的亲和力和独特的抗原决定簇识别位点，能够在HbA1c抗原的免疫检测特别是双抗体夹心法中获得优异的检测效率。体夹心法中获得优异的检测效率。体夹心法中获得优异的检测效率。

【技术实现步骤摘要】
一种抗HbA1c的纳米抗体及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及抗体制备
，尤其涉及一种抗HbA1c的纳米抗体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]1993年布鲁塞尔自由大学的Hamers
‑
Casterman等首先报道了骆驼血液中除了传统的IgG抗体外还存在另一种类型的抗体，与传统的哺乳动物抗体IgG分子结构不同，这种抗体既缺失传统抗体的轻链，也缺少重链恒定区的CH1区域，被称为重链抗体(Heavy chain antibody，HcAb)。其抗原结合部位，即可变区，也被称为VHH区，采用分子生物学技术直接克隆并重组表达VHH，可以获得上述可变区片段，被称为单域抗体，通常仅有110
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130个氨基酸组成，分子量仅有12
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15kDa，因此也被称为纳米抗体。纳米抗体远远小于传统完整抗体(150
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160kDa)及其Fab片段(约50kDa)，但却能具备与传统抗体相似或更高的特异性抗原亲和力。单域抗体固有的分子量小、理化特征稳定、亲和力高和易于重组表达制备的特点使得其在被发现后备受关注，经过20多年的研究，在免疫研究、诊断检测、医学和生物学成像、治疗性抗体发展等领域的应用均取得了积极进展。
[0003]糖化血红蛋白(HbA1c)是血液中红细胞内血红蛋白与血糖结合的产物，与血液中葡萄糖的浓度成正比，可反映120天前的血糖水平。且糖化血红蛋白不受抽血时间、是否空腹、是否使用胰岛素以及其他能使血糖水平短暂波动的因素影响。糖化血红蛋白由HbA1a、HbA1b、HbA1c组成，其中HbA1c占约70％，且结构较为稳定，临床上常用作糖尿病控制的监测指标，其浓度用占成人血红蛋白的百分比表示。糖化血红蛋白检测特异性强、重复性好、灵敏度高，对糖尿病的筛查和监控有重要意义。
[0004]随着人民生活水平的不断提高和人口的老龄化进程加快，糖尿病患者总数也在急剧膨胀，各个国家糖尿病患者和潜在的糖尿病患者也在迅速增多，以目前形式发展，到2030年全球糖尿病患者人口总数将达3.5亿人。但目前测定HbA1c的主流方法是直接胶乳免疫比浊法，需要相对应的抗体，在灵敏度和操作稳定性上均存在一定的缺陷。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题是提供一种力纳米抗体的筛选方法，从而快速的获得高亲和力纳米抗体
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：提供一种抗HbA1c的纳米抗体制备方法，包括以下步骤：
[0007]S1、构建纳米抗体噬菌体展示文库；
[0008]S2、基于所述纳米抗体噬菌体展示文库进行HbA1c纳米抗体的筛选以及原核表达验证；
[0009]其中，所述步骤S1中，包括如下步骤：
[0010]A1、制备高活性免疫抗原并免疫目的动物；
[0011]A2、分离所述目的动物的外周血淋巴细胞提取RNA，经过反转录获得cDNA；
[0012]A3、以所述cDNA为模板进行两轮PCR扩增获得纳米抗体片段，再将所述纳米抗体片段与展示载体连接，构建纳米抗体基因文库以及纳米抗体展示文库。
[0013]优选地，所述高活性免疫抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，基因合成后，如SEQ ID NO.2所示，所述高活性免疫抗原经过合成并构建到哺乳动物表达载体上，通过PEI瞬时转染至293F细胞中表达，再经过His标签纯化抗原。
[0014]优选地，所述步骤A1中，将高活性免疫抗原与弗氏佐剂按照1：1比例混合后，按照0.5mg/次的剂量对所述免疫动物进行背部皮下多点注射的方式免疫，共免疫4次，免疫间隔为2周，所述目的动物为羊驼。
[0015]优选地，所述步骤A3中，以所述cDNA为模板进行两轮PCR扩增获得纳米抗体片段的具体方法如下：取免疫动物外周血10ml，分离PBMC并提取RNA，经过反转录获得cDNA，所用引物为随机引物，如SEQ ID NO.3所示。并以获得的cDNA为模板进行PCR扩增，以获得纳米抗体基因文库，两轮PCR所用引物分别为SEQ ID NO.4与SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6与SEQ ID NO.7。
[0016]优选地，所述步骤A3中，所述展示载体为pad1
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10b噬菌体展示载体。
[0017]优选地，所述步骤A3中，将所述目的动物的纳米抗体片段与所述展示载体连接，而后转化感受态细胞SS320，制备纳米抗体基因文库，再采用辅助噬菌体M13K07感染所述纳米抗体文库制得纳米抗体展示文库。
[0018]优选地，所述步骤S2中，纳米抗体原核表达为：将筛选的高亲和力纳米抗体序列经过PCR扩增，与pET 32a载体连接后，转化至TG1感受态细胞中，再将构建好的质粒转化BL21(DE3)中，经过IPTG诱导表达，使用经His标签介导的Ni
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Agorose亲和层析，然后经过superdex 200凝胶介质进行精细纯化。
[0019]优选地，所述步骤S2中，纳米抗体原核表达为：将筛选的高亲和力纳米抗体序列经过PCR扩增，与pET 32a载体连接后，转化至SS320感受态细胞中，再将构建好的质粒转化Origami B(DE3)中，经过IPTG诱导表达，使用经His标签介导的Ni
‑
Agorose亲和层析。
[0020]优选地，所述步骤S2中，纳米抗体的验证为：以HbA1c抗原包被酶标版，3％BSA封闭，PBST洗涤。加入不同浓度稀释的100ul纳米抗体，室温孵育12h，用PBST洗涤5次，加入羊抗羊驼
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HRP反应30min，用PBST洗涤5次，加入TMB显色30min，终止后在酶标仪上检测。
[0021]本专利技术提供了一种抗HbA1c纳米抗体及其应用方法，具备以下有益效果：
[0022]1、该抗HbA1c纳米抗体及其应用方法，能够充分发挥纳米抗体的优越性能，既具有高度特异的抗原识别能力，具有高度的亲和力，并且具有独特的抗原决定簇识别位点，能够在HbA1c抗原的免疫检测特别是双抗体夹心法中获得优异的检测效率。
[0023]2、利用该抗HbA1c纳米抗体制备的HbA1c检测试剂盒(荧光免疫层析)能满足以下性能要求：
[0024]1)线性范围：在4％～14％范围内，临床相关系数r值≥0.990。
[0025]2)准确度及精密度：相对误差在
±
12％内。
[0026]3)最低检测限：≤4％。
附图说明
[0027]为了更清楚地说明本专利技术实施例技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0028]图1为本专利技术特异性抗原制备示意图
[0029]图2为本专利技术纳米抗体第一轮PCR结果示意图；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗HbA1c的纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、构建纳米抗体噬菌体展示文库；S2、基于所述纳米抗体噬菌体展示文库进行HbA1c纳米抗体的筛选以及原核表达验证；其中，所述步骤S1中，包括如下步骤：A1、制备高活性免疫抗原并免疫目的动物；A2、分离所述目的动物的外周血淋巴细胞提取RNA，经过反转录获得cDNA；A3、以所述cDNA为模板进行两轮PCR扩增获得纳米抗体片段，再将所述纳米抗体片段与展示载体连接，构建纳米抗体基因文库以及纳米抗体展示文库。2.根据权利要求1所述的抗HbA1c的纳米抗体的制备方法，其特征在于：所述高活性免疫抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，基因合成后，如SEQ IDNO.2所示，所述高活性免疫抗原经过合成并构建到哺乳动物表达载体上，通过PEI瞬时转染至293F细胞中表达，再经过His标签纯化抗原。3.根据权利要求1所述的抗HbA1c的纳米抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤A1中，将高活性免疫抗原与弗氏佐剂按照1：1比例混合后，按照0.5mg/次的剂量对所述免疫动物进行背部皮下多点注射的方式免疫，共免疫4次，免疫间隔为2周，所述目的动物为羊驼。4.根据权利要求1所述的抗HbA1c的纳米抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤A3中，以所述cDNA为模板进行两轮PCR扩增获得纳米抗体片段的具体方法如下：取免疫动物外周血10ml，分离PBMC并提取RNA，经过反转录获得cDNA，所用引物为随机引物，如SEQ ID NO.3所示，并以获得的cDNA为模板进行PCR扩增，以获得纳米抗体基因文库，两轮PCR所用引物分别为SEQ ID NO.4与SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6与SEQ ID NO.7。5.根据权利要求1所述的抗HbA1c的纳米抗体的制备方法，其特征在于：所...

【专利技术属性】
技术研发人员：李泓彦，胡利华，范海艳，赖燕晖，梁树旺，李琦，
申请(专利权)人：深圳市艾伟迪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：